响应面法优化辛烯基琥珀酸籽粒苋淀粉酯制备工艺

陈樱,汪之禾,王亚娟,仇丹

（宁波工程学院 材料与化学工程学院,浙江 宁波 315211）

0 引言

籽粒苋（Amaranthus）是一类古老的可粮饲兼用的、苋科苋属的草本植物，主要有A.hypochondriacus，A.cruentus和A.caudates等品种，常见的有K112、R104和K45等[1]。因其适应性广、抗逆性强、营养丰富和产量大等特点，在国外，籽粒苋制作出的食品被视为极富营养价值，从而得到很多消费者青睐，因此关于籽粒苋的研究已成为国内外研究的热点之一[2-5]。籽粒苋的籽实中含有约15%～22%的蛋白质、58%～66%的淀粉、6.88%左右的脂肪、9%～16%的膳食纤维，及丰富的维生素和矿物质[6]，而籽粒苋的品种是造成这些营养素含量不同的主要原因，因此目前国内外研究领域主要致力于籽粒苋的育种栽培，及其中蛋白质、脂肪等的研究。

也有部分学者将关注点放在作为淀粉的使用上，比如夏雪娟等人[7]研究比较了玉米、木薯、红薯和籽粒苋淀粉的理化性，结果发现：K112品种籽粒苋淀粉的溶解度、透明度及沉降速率均低于其他三种淀粉，且其冻融稳定性较差；BHOSALE等学者[8-9]使用辛烯基琥珀酸酐（OSA）对籽粒苋淀粉进行改性，发现其冻融稳定性有较大幅度的提升，且改性后粘度增加；吴媛莉等人[10]探究了籽粒苋淀粉经OSA疏水化改性后用作Pickering乳化剂，发现高取代度的OSA改性籽粒苋淀粉可得到稳定性较好的乳液。但是对于籽粒苋淀粉的酯化工艺优化方面的研究未见涉及，而籽粒苋淀粉颗粒呈多角形，粒径较小在0.5～3μm[7]，将其使用OSA酯化后有望作为颗粒乳化剂使用。同时，在这些研究者的工作中涉及到的OSA与淀粉反应得到产物的取代度（DS）均使用滴定法测定，而该方法忽略了游离辛烯基琥珀酸的含量，从而降低了结果的准确性。因此，本研究采用高效液相法为检测手段，以籽粒苋淀粉酯的DS为响应值，通过单因素试验确定影响规律，然后采用响应面法优化最佳酯化参数，以期为高效、经济地生产OSA改性苋菜籽淀粉提供参考。

1 试验条件与方法

1.1 材料与试剂

籽粒苋籽实（R104），山东省曹县草业科技研究中心；辛烯基琥珀酸酐，分析纯，上海能源化工有限公司；乙腈和甲醇，色谱纯，天津赛福科技有限公司；其他化学品为分析纯。

1.2 仪器与设备

HR2094粉碎机，飞利浦；TDZ5-WS台式低速离心机，湘仪仪器有限公司；GZX-9140MBE型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司；Agilent 1260高效液相色谱仪，Waldbronn，Germany；ZD-2型自动滴定仪，上海精密科学公司；KMS-181E型水浴锅，上海崇丰科学仪器有限公司。

1.3 籽粒苋淀粉的提取

淀粉的提取参考KONG[11]的研究方法，从籽粒苋籽实中提取淀粉。具体操作如下：在0.1 mol/L氢氧化钠水溶液中加入籽粒苋籽实，4℃的条件下浸泡24 h；用粉碎机打浆约3 min，然后过滤，用去离子水洗涤滤渣，直至不能洗出白色淀粉；于3 000 r/min下离心10 min，下层沉淀于50℃烘箱中干燥并研磨，得到籽粒苋淀粉（Amaranth starch,简称AS）。

1.4 辛烯基琥珀酸籽粒苋淀粉酯（OSAS）的制备

试验方法参照ZHU[12]等人，并做适量修改。具体为：称取10.0 g AS于四口烧瓶中，加适量去离子水配成一定浓度的淀粉乳，用3%NaOH溶液调节淀粉乳pH至一定值，继续搅拌20 min；而后在5 min内缓慢加入淀粉重3%的OSA，期间使用自动电位滴定仪检测并维持反应的pH。在设定温度下反应一定时间后，使用0.1 mol/L盐酸调节pH至7.0，过滤并用去离子水及无水乙醇各洗3次，后将沉淀置于80℃的烘箱中干燥得OSAS。OSAS的取代度使用QIU等[13]的方法测定，液相色谱参数：安捷伦Agilent1260高效液相色谱仪，ZORBAX-SB-C18柱；流动相：乙腈和水（0.1%三氟乙酸（TFA））的混合物（45:55，v/v）；检测波长为200 nm；流速1 mL/min；检测温度为30℃；进样量20μL。

1.4.1 单因素试验

以淀粉酯中DS为指标，进行单因素试验，研究淀粉浓度、反应温度、pH及反应时间四个因素对反应效率的影响。

1.4.2 响应面设计

利用Box-Behnken的方法对影响DS值的重要参数的水平和变量间的交互作用进行分析和优化，其因素和水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平

1.4.3 数据分析

试验所得数据均为3次试验的平均值。使用软件Design-Expert（Version 10.0.5，State-Ease Inc.,Minneapolis,Minnesota,USA）对数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 淀粉乳浓度对OSAS取代度的影响

籽粒苋淀粉乳浓度对其酯化产物DS的影响见图1。如图1所示，在淀粉乳浓度为10%～30%范围内，随着籽粒苋淀粉浓度的增加，相应的OSAS的DS几乎呈线性增加；而当浓度大于30%后，因浓度的增加使得淀粉乳液的粘度增大，进而导致淀粉酯中的DS降低。因此反应淀粉乳浓度优选30%，该浓度较美人蕉、籼稻和糯玉米淀粉的最佳浓度都低[14-15]，原因为籽粒苋淀粉颗粒较小，随着粒径的减小，淀粉的表面能增加，使淀粉颗粒更容易团聚。

2.1.2 酯化温度对OSAS取代度的影响

酯化反应温度的升高可增加OSA的溶解度，同时也会促进淀粉颗粒的溶胀性，使得OSA与淀粉颗粒接触的几率增加，从而可在一定程度上加快反应速率[14]。图2结果显示：随着酯化反应温度从30℃升高到60℃，OSAS的DS值不断增加。但由于温度超过60℃，籽粒苋淀粉会糊化，进而破坏淀粉的颗粒结构，同时当反应温度在60℃时，OSAS的取代度为0.017 3，可达到大部分淀粉酯作为乳化剂的使用要求，故本试验研究酯化温度为60℃。

图1 淀粉乳浓度对取代度的影响

图2 酯化温度对取代度的影响

2.1.3 pH对OSAS取代度的影响

pH对取代度的影响如图3所示。随着pH的增加，取代度先增大后减小，当pH为8.5时，DS达到最大值。该结果可表明：当pH小于8.5时，不能充分活化籽粒苋淀粉的羟基以进行酸酐部分的亲核反应，而选pH大于8.5则有利于酸酐水解[15]。因此，选择pH为8.5进行进一步研究。

2.1.4 反应时间对OSAS取代度的影响

图4展示了反应时间对OSAS取代度的影响。当反应时间从30 min增加到90 min，DS值显著增加，主要借助于OSA在淀粉颗粒中的扩散和吸附作用[16]；而超过90 min后，反应时间对DS无明显影响。对比美人蕉和大米淀粉的酯化条件，籽粒苋淀粉酯化达到平衡的时间相对较短[17]，主要还是由于其粒径较小，OSA扩散到淀粉颗粒表面所需的时间短。

图3 pH对取代度的影响

图4 反应时间对取代度的影响

2.2 响应面试验及结果

在单因素试验结果的基础上，以反应时间（A）、反应温度（B）和反应pH（C）三个因素做自变量，以OSAS的取代度DS为响应值（Y），采用响应面法探究籽粒苋淀粉在不同条件下的取代度，试验方案及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果

使用Design-Expert软件对DS进行回归分析，得到响应值（YDS）与反应时间（A）、温度（B）和pH值（C）之间的二次多元回归方程：

该方程的相关系数R2为0.950 6，表明该模型对试验结果拟合度高，数据可靠。通过ANOVA对上述结果进行方差分析，结果见表3。

表3 方差分析

如果模型中每个项的F值较大且P值较小，则响应变量是显著的。因此，回归方程的方差分析结果表明，因子A（时间）、B（温度）、C（pH）、A2（时间的平方）和C2（pH的平方）是显著的模型项（P＜0.05)。在试验所选的三个因素中，对DS的影响顺序为：反应时间＞pH＞反应温度。

采用Design-Expert10.0分析软件获得两因素交互作用的响应面图见图5，两因素交互项的三维图越陡峭，等高线呈椭圆形则表明对响应值的影响越显著。图5中的陡峭顺序为：AC＞BC＞AB，即时间与pH的交互项最陡峭，表明反应时间与pH的交互作用对OSAS的酯化程度影响最显著，这与模型的方差分析相符。

图5 两因素的交互作用对OSAS的取代度的响应面图：

利用Design-Expert 10.0软件进行工艺参数的优化组合，得到预测的籽粒苋淀粉酯化最佳工艺条件为：反应pH 8.3、反应时间84 min及温度48.1℃，预测的DS为0.020 4。为了验证模型的有效性，考虑到实际情况将最佳提取条件定为：反应pH 8.3、反应时间90 min及温度48.0℃，在此工艺下，淀粉酯的取代度为HPLC法测定为0.020 2，滴定法测定为0.021 1，与预测值总体吻合，说明该模型合理。

3 结论

本研究利用碱提法从籽粒苋籽实中提取了籽粒苋淀粉颗粒，通过响应面分析建立了水相法制备籽粒苋淀粉酯的二次多项式数学模型，结果如下：

（1）反应时间对籽粒苋淀粉酯的反应效率影响最显著，其次是pH。在所选的3个因素中，反应温度的影响最小。

（2）淀粉酯的取代度（DS）与反应时间（A）、温度（B）和pH（C）间的多元回复方程为：

（3）辛烯基琥珀酸籽粒苋淀粉酯的最佳工艺条件为：淀粉浓度30%，反应时间84 min，pH 8.3，反应温度48.1℃。在此条件下得到的籽粒苋淀粉酯的理论取代度为0.020 4，验证试验中OSAS的取代度为0.020 2，与预测值相对误差为0.98%。

综上说明可以用此回归模型对籽粒苋淀粉的辛烯基琥珀酸酯化进行分析和预测。