基于EPO介导的JAK2/STAT5信号通路研究百会、大椎刺络促缺血性脑卒中后血管新生的调控机制

王保国，曹 奕，陈倩倩，张静波，高 纺，张 璨，施婧婧，周文婷

(1.安徽中医药大学第二附属医院，安徽 合肥 230061；2.安徽中医药大学，安徽 合肥 230012)

缺血性脑卒中是临床常见的一种缺血性脑血管病，占急性脑血管病的70%左右，具有高发病率、高致残率、高死亡率的特点，给社会带来了严重的经济负担[1]。缺血性脑卒中后缺血区域血管新生具有至关重要的作用，是保证缺血脑组织在短时间内重新获取氧分的内源性保护机制，侧支血管的建立可改善缺血区域微循环，增加局部脑缺血区血流灌注，从而促进机体神经功能缺损症状的恢复[2]。脑梗死后缺血区域血管新生是由多种生物因子及多条信号通路共同参与的复杂过程[3]。促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是一种由肝脏、肾脏分泌的酸性糖蛋白，与其相应受体结合后可使相邻受体发生同源二聚化，导致JAK酪氨酸激酶激活，JAK是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶，该族成员有7个同源区，其中2区为伪激酶区，因其既能催化与之相连的细胞因子受体发生酪氨酸磷酸化，从而激活多个下游信号通路，其中JAK2及其介导的STAT5通路是常见的下游信号通路之一，而此信号通路是目前已发现的与血管新生有关的一条分子信号通路[4]。有学者运用EPO对大脑中动脉局灶性脑缺血再灌注模型(middle cerebral artery occlusion/reperfusion model，MCAO/R)大鼠进行干预后发现，缺血区域存在血管新生现象，同时研究[5]证实了小鼠脑缺血区域血管新生现象与EPO介导的内皮细胞增殖分化有关。

近些年来中医临床对于缺血性脑卒中的治疗也在逐步发展，针灸作为临床常见中医疗法之一，其干预缺血性脑卒中机制是一种多种途径共同参与的复杂过程，如改善缺血区微循环、促进缺血区血管新生、对抗脑缺血后炎症反应、保护脑组织、改善神经功能缺损、改善血液流变性[6]。中医刺络疗法具有活血化瘀、祛瘀生新之功，结合督脉上通于脑窍的特性，取其要穴百会、大椎进行刺络治疗，可使脑窍“瘀血祛、新血生”，以达祛瘀生新之效。前期研究[7]表明，百会、大椎刺络可调节缺血性脑卒中患者脑组织氧合血红蛋白饱和度及血流量，改善血液流变学的各项指标，能显著改善患者的神经功能缺损症状，但其作用机制仍不清晰。因此，为进一步研究百会、大椎刺络改善缺血性脑卒中后血管新生的作用机制，本研究以EPO介导的JAK2/STAT5信号通路调控血管新生的机制为切入点，探讨百会、大椎刺络治疗缺血性脑卒中的作用机制。

1 材料

1.1 试剂 苏木精染色液(批号 BA-4041)、伊红染色液(醇溶性)(批号 BA-4022)：Baso；中性树胶(批号 10004160)：国药集团；Trizol(批号 15596018)：Life technogies；SYBR Green染料(批号 E096-01B)：novoprotein；RNA引物：上海生工生物工程股份有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(批号 RR047A)：TaKaRa；P-JAK2(批号 ab32101)：Abcam；P-STAT5(批号 bs-5620R)：北京博奥森生物技术有限公司；血管内皮生长因子(vascular endothetial grow factor,VEGF)(批号 SC-7269)：Santa Cruz；β-actin(批号 TA-09)、山羊抗兔IgG(批号 ZB-2301)、山羊抗小鼠IgG(批号 ZB-2305)：北京中杉生物技术有限公司；ECL超敏发光试剂盒(批号 340958)：Thermo。

1.2 仪器 生物组织自动脱水机(ZT-12M)、生物组织包埋机(YB-7LF)、生物组织烤片机(YT-7FB)：湖北亚光；徕卡切片机(RM2016)：Leica；显微镜(CX41)：OLYMPUS；高速冷冻离心机(JW-3021HR)：安徽嘉文仪器装备有限公司；荧光定量PCR仪(PIKOREAL 96)：Thermo Scientific；普通PCR仪(K960)：杭州晶格科学仪器有限公司；超微量分光光度计(OD1000+)：南京五义科技有限公司；Western电泳仪(EPS300)、转膜仪(VE-186)：上海天能科技有限公司；自动曝光仪(JS-1070P)：上海培清科技有限公司。

2 方法

2.1 实验动物与分组 SD雄性大鼠150只，SPF级，体质量(220±20)g，日龄42～49 d，购于江苏省邳州市东方养殖有限公司，生产许可证号：SCXK(苏)2017-0003。实验动物在安徽中医药大学实验动物中心饲养，饲养条件为Ⅱ级，光照周期12 h/12 h，室温为22～25 ℃，相对湿度为45%～60%，自由进食、饮水。适应性饲养7 d后将150只SD大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型对照组、刺络治疗组、刺络+EPO拮抗组，每组30只。

2.2 模型制备及干预方法 正常对照组不进行手术，假手术组仅分离血管而不插线栓，模型对照组、刺络治疗组、刺络+EPO拮抗组采用改良的Zea-Longa法制备MCAO/R模型大鼠，并参考经典的Zea-Longa法判定模型成功与否[8-10]。模型制备后刺络治疗组、刺络+EPO拮抗组采用“百会”“大椎”穴刺络进行干预，取穴标准参照《常用动物腧穴图谱》[11]。将大鼠固定于鼠板上，采用特制的大鼠头部固定器固定大鼠头部，在保持其清醒状态下剃毛标记，百会、大椎穴采用0.45号一次性使用无菌注射针(江苏苏云医疗器材有限公司，生产批号：20200221)点刺，使其出血，每次每穴1滴(出血量为0.05 mL)，每隔24 h进行刺络治疗1次，连续治疗3周，并于取材前1 h进行最后1次刺络治疗。刺络+EPO拮抗组在刺络前将脂质体-siEPO2复合物按5 mg/kg剂量对大鼠进行腹腔注射，使之进入合成EPO的靶细胞，在细胞内引起针对EPO的RNA干扰效应。

2.3 取材及指标检测

2.3.1 组织取材 采用2%戊巴比妥钠按2 mL/kg剂量腹腔注射麻醉大鼠后，剪开腹腔，腹主动脉放血后断头处理大鼠，每组取一半大鼠全脑于4%多聚甲醛(预冷)中固定24 h后常规脱水、石蜡包埋制作切片(厚度为5 μm)；每组另一半大鼠取左脑顶叶组织置于冻存管中，保存于-80 ℃冰箱中。

2.3.2 苏木精-伊红染色观察各组大鼠脑皮质病理形态 将各组大鼠脑皮质组织样品在冰冻切片条件下完成均质化，进行固定、组织脱水、包埋，待蜡液出现凝固层后，冰浴凝固，用加热的外科刀按组织块位置修整蜡片，然后浸入苏木精染液与伊红染液染色5 min，1%盐酸乙醇溶液分化数秒，稀碳酸锂水溶液蓝化30 s，纯水冲洗后入伊红染色液(醇溶性)染色10～30 s，95%乙醇Ⅰ、Ⅱ中各调色约10 s，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ中各脱水2 min，苯酚-二甲苯、二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各透明2 min，中性树胶封片，使用显微镜进行拍照以观察脑皮质组织病理状态。

2.3.3 RT-PCR法检测各组大鼠缺血脑皮质中EPO、VEGF的mRNA表达水平 取样本加入适量TRIzol试剂，通过匀浆机进行匀浆处理，随后进行分层、沉淀、清洗及溶解等步骤制得RNA备用，制备过程注意使用无酶枪头。取制备好的总RNA进行反转录成cDNA，然后加入SYBR Green染料与VEGF、EPO及β-actin上下游引物混合离心(引物序列见表1)，随后于PCR仪上进行扩增，循环完成后作溶解曲线。以采集到的荧光信号值进行相对定量分析。

表1 所选基因引物序列

2.3.4 Western Blot法检测各组大鼠脑皮质中P-JAK2、P-STAT5、VEGF蛋白表达水平 取100 mg组织，加入600 μL RIPA裂解液(含蛋白酶抑制剂)后匀浆，提取蛋白，测量蛋白浓度，沸水浴变性后备用。将提取的总蛋白进行电泳、转膜。5%脱脂奶粉，分别孵育P-JAK2、P-STAT5、VEGF及β-actin(1∶1 000)抗体，4 ℃过夜。洗膜，室温孵育二抗1.5 h(山羊抗小鼠1∶20 000，山羊抗兔1∶20 000)。洗膜，均匀涂抹ECL超敏化学发光液，于成像系统曝光拍照，使用Image J软件对各组蛋白的相对灰度值进行分析。

3 结果

3.1 各组大鼠脑皮质病理形态学观察 正常对照组与假手术组神经细胞数量多，排列整齐，形态基本正常，细胞核位于细胞中央；模型对照组及刺络+EPO拮抗组大鼠脑组织疏松，神经细胞排列紊乱，细胞核固缩，颜色深染。与模型对照组相比，刺络治疗组脑组织形态明显恢复，细胞核固缩较模型组程度低，神经细胞正常结构消失但大体形态存在。见图1。

3.2 各组大鼠脑皮质中EPO、VEGF mRNA表达水平比较 与正常对照组比较，假手术组大鼠脑皮质中EPO、VEGF mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，模型对照组大鼠脑皮质中EPO、VEGF mRNA表达水平显著升高(P<0.05)；与模型对照组比较，刺络治疗组大鼠脑皮质中EPO、VEGF mRNA表达水平进一步升高(P<0.05)；与刺络治疗组比较，刺络+EPO拮抗组大鼠脑皮质中EPO、VEGF mRNA表达水平降低(P<0.05)。见图2。

注:A.正常对照组;B.假手术组;C.模型对照组;D.刺络治疗组;E.刺络+EPO拮抗组;箭头所示为神经细胞核固缩

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，△P<0.05；与刺络治疗组比较，#P<0.05

3.3 各组大鼠脑皮质中P-JAK2、P-STAT5、VEGF蛋白表达水平比较 与正常对照组比较，假手术组大鼠脑皮质中P-JAK2、P-STAT5、VEGF蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，模型对照组大鼠脑皮质中P-JAK2、P-STAT5、VEGF蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与模型对照组比较，刺络治疗组大鼠脑皮质中P-JAK2、P-STAT5、VEGF蛋白表达水平进一步升高(P<0.05)；与刺络治疗组比较，刺络+EPO拮抗组大鼠脑皮质中P-JAK2、P-STAT5、VEGF蛋白表达水平降低(P<0.05)。见图3。

注：A.正常对照组；B.假手术组；C.模型对照组；D.刺络治疗组；E.刺络+EPO拮抗组；与正常对照组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，△P<0.05；与刺络治疗组比较，# P<0.05

4 讨论

缺血性脑卒中是中国常见的老年患者突发疾病，《中国脑卒中防治报告(2019)》中指出，中国缺血性脑卒中的发病率、致残率与死亡率均处于较高水平[12]。因此，有效的预防和治疗方法及其作用机制是目前临床研究的热点。对于缺血性脑卒中，缺血是脑卒中的始因和核心，并贯穿疾病病理演变的全过程[13]。本研究通过改良的Zea-Longa法制备MCAO/R模型大鼠作为研究对象，研究结果显示，模型对照组大鼠脑皮质病理损伤明显，提示MCAO/R大鼠模型复制成功。国内研究结果显示，刺络疗法可改变微循环障碍，减轻红细胞聚集现象，增加血氧含量，并减少血管渗出，从而改善脑梗死患者的血液高凝状态[14-15]。另有研究[16]认为，刺络疗法可能是通过血流动力学调节血管内皮细胞的分泌功能，进而强化血管功能，改善局部微循环。中医针灸理论中，百会穴为“百穴之巅”[17]，大椎穴为“诸阳之会”[18]，两穴同为督脉要穴。两穴合用，取其刺络，可泻阳之亢、祛络之瘀，以达祛瘀生新之效。本研究显示，通过百会、大椎刺络治疗，MCAO/R大鼠脑组织、神经细胞等病理损伤情况得到显著改善。

血源性EPO作为一种巨大糖蛋白，有研究[19]表明，在脑缺血后EPO因为血脑屏障的破坏而进入脑部，并与特异性受体结合，以胞吞等方式通过血脑屏障运输到达脑靶位起到保护受损脑组织的作用。EPO与受体结合后引起受体的构象发生改变，促使相邻的2个受体互相靠近发生同源二聚化，导致2个JAK2 酪氨酸激酶激活，然后促红细胞生成素受体的多个酪氨酸残基被磷酸化，激活JAK/STAT通路，促进红系祖细胞的增殖和分化[20]。本研究结果显示，MCAO/R大鼠脑皮质区EPO、P-JAK2、P-STAT5的表达水平显著上升，百会、大椎刺络治疗后，MCAO/R大鼠脑皮质区EPO、P-JAK2、P-STAT5的表达水平进一步上升。而当通过EPO抑制剂抑制EPO的表达时，大鼠脑组织中P-JAK2与P-STAT5表达水平显著降低，提示EPO能通过介导JAK2/STAT5通路发挥作用。

VEGF是一种分泌的二聚体蛋白，参与许多生物学过程，如维持内皮细胞完整性，增加微血管密度，提高短暂性脑缺血后神经细胞存活[21-23]。其不仅能促进血管内皮细胞的增殖，增加血管通透性，最主要的功能还是参与血管新生。研究[24-25]表明，VEGF还是JAK/STAT通路下游的关键因子。本研究结果显示，百会、大椎刺络能够显著提升MCAO/R大鼠脑皮质区的VEGF水平，提示局部血管新生水平增加，当通过EPO抑制剂抑制EPO表达时，大鼠脑组织中VEGF表达水平显著降低，提示抑制EPO的表达能够抑制MCAO/R大鼠梗死区域血管新生。

综上所述，百会、大椎刺络治疗MCAO/R模型大鼠能够促进脑血管新生，其机制可能与上调EPO的表达，激活JAK2/STAT5信号通路有关。