苦杏仁多肽的制备及其抗氧化活性研究

张爱莉，曹丙林，张 良，崔朝辉，胡永生，王家占，卢作焜

(1．许昌学院 食品与药学院，河南 许昌 461000；2．许昌学院 河南省食品安全生物标识快检技术重点实验室，河南 许昌 461000)

生物活性肽是对人体功能具有有益影响、或特定生理调节作用的肽类化合物[1].由于生物活性肽能够与其它蛋白质或靶点相互作用从而调节人体生理过程，因而其生物活性与氨基酸序列关系密切[2].生物活性肽更易于人体吸收利用，并且容易加工[3].活性肽具有很多对人体有益的功效，例如预防衰老、改善细胞代谢等，部分生物活性肽对预防肿瘤、降低血压等方面[4].越来越多的研究致力于从食品产品及未充分利用的富含蛋白质的食品工业副产品中寻找加工和生产中产生的生物活性肽[5].生物活性肽来源广泛，其中应用最多的是从鸡蛋、牛奶及肉中提取的生物活性肽[6].部分来源于海洋生物蛋白质的多肽甚至具有抗肿瘤活性[7].食物蛋白质来源的生物活性肽一般通过酶水解[8]和微生物发酵[9，10]进行生产.

苦杏仁中含有特有的苦杏仁苷，具有良好的药用价值[11].由杏仁蛋白水解制得的生物活性肽—杏仁多肽，其应用开发并没得到充分的重视[12].因此，以苦杏仁为研究对象，通过酸沉淀法提取总蛋白，利用响应面法优化抗氧化肽酶解工艺，得到最佳工艺参数.研究对苦杏仁抗氧化肽活性的优化提供了一定程度的理论数据，同时为中药苦杏仁的进一步开发利用提供基础.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苦杏仁：河北省霍山县兆麟堂生物科技有限公司；蛋白酶K、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)：郑州派尼化学试剂厂.

TDZ5-WS多管架自动平衡离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；TGL-16C高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂.

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理

将苦杏仁首先经万能高速粉碎机粉碎，然后用石油醚(沸程30～60 ℃)对其进行脱脂，按料液比1∶ 1.5脱脂3次.放入通风橱内通风挥发，经24 h后拿出，放入烘干箱50 ℃烘干6 h，过筛得脱脂苦杏仁粉.

1.2.2 苦杏仁蛋白与多肽的制备

首先称取50 g苦杏仁粉，以1∶ 16的料液比加入0.1 mol·L-1的氯化钠溶液，磁力搅拌器搅拌30 min后加入0.1 mol·L-1的氢氧化钠溶液，调节溶液的pH值为9.0.随后使用四层纱布过滤取上清液倒入50 mL离心管中，3 800 r·min-1离心15 min，上清液调节至pH=4.1，静置10 min.最后3 800 r·min-1离心15 min，将沉淀进行冷冻干燥得到苦杏仁粗蛋白粉，置于干燥皿中保存备用.苦杏仁蛋白粉溶解在含有50 mmol·L-1pH为8.0的Tris-HCl和10 mmol·L-1CaCl2溶液中，每0.8 mL蛋白溶液加入2 μl的蛋白酶K溶液(5 mg·mL-1).

1.2.4 单因素实验

以DPPH清除率为指标，只改变一个因素其他因素保持不变，探究水浴时酶解温度、酶解时间、蛋白底物浓度三个因素对苦杏仁酶解液DPPH清除率的影响.

1.2.5 DPPH自由基清除率计算方法

称取0.001 4 g DPPH 粉末，以无水乙醇为溶剂，在100 mL褐色容量瓶中定容，并避光保存.取1 mL无水乙醇+1 mL DPPH溶液于EP管中充分混匀，避光条件下反应30 min为空白对照组A0，于波长517 nm处使用分光光度计测其吸光值.Ai为样品值(0.2 mL样品+0.8 mL无水乙醇、1 mL DPPH溶液)的吸光度；A裂为样品本身(0.2 mL裂解液+1.8 mL无水乙醇)的吸光度.计算公式为

1.2.6 响应面试验

将由单因素实验得出的3个最佳条件作为自变量，酶解液DPPH自由基清除率为响应值，以每个单因素实验结果的最适值为中心，在其区域内往上取一个水平值作为水平1，往下取一个水平值为-1，设计3因素3水平17个试验点的Box-Behnken试验.采用Design-expert 12进行处理，所有试验均重复三次.

2 结果与讨论

2.1 因素实验结果

2.1.1 酶解温度对酶解效果的影响

由图1可知，酶解液的DPPH清除率受水浴温度的影响较为明显，到50 ℃之后，DPPH清除率迅速下降.因此选取酶解温度为50 ℃.

图1 酶解温度对DPPH清除率

2.1.2 酶解时间对酶解效果的影响

由图2可知，在前2 h，DPPH自由基清除率受酶作用的时间增长趋势明显；酶解2 h后，虽然酶解时间一直在继续，但清除率的增长却并不明显；到达2 h之后，酶解反应趋于平衡，产物不再增加，清除率增长不明显.

图2 酶解时间对DPPH清除率的影响

图3 底物蛋白浓度对酶解效果

2.1.3 底物蛋白浓度对DPPH清除率的影响

在酶解温度为50 ℃、酶解时间为1.5 h条件下，当底物蛋白浓度慢慢增加时(5、10、15、20、25 mg·mL-1)，酶解产物的DPPH自由基清除率先升高后降低，在底物蛋白浓度为10 mg·mL-1时清除率到达最高点(图3).原因可能是随着底物蛋白浓度的增加，底物蛋白和活性多肽进一步被降解，导致DPPH自由基清除活性降低；也可能是随着酶解液浓度增大，蛋白分子之间互相影响，酶与底物蛋白之间的相互作用点减少，间接影响了底物蛋白分子与酶之间的反应.因此最佳酶解液浓度为10 mg·mL-1.

2.2 响应面优化

2.2.1 响应面模型的建立及结果

通过确定的响应面试验因素水平表，以DPPH自由基清除率为考察指标，研究各因素对DPPH自由基清除率的影响，从而确定最佳酶解工艺条件.响应面试验结果如表2所示.

表2 响应面分析的试验结果

2.2.2 方差分析

采用Design-expert 12软件，对实验数据进行计算分析，得到底物蛋白浓度(A)、酶解温度(B)、酶解时间(C)与DPPH自由基清除率(Y)之间的回归方程为

Y=-4.5625A+5.8125B-2.175C-3.15AB-0.475AC-0.325BC-12.045A2-10.645B2-6.42C2+62.94.

为了更好地探究此方程的可靠性，进一步探究响应值与各因素之间的关联程度，对该回归方程进行方差分析(表3).

表3 二次响应面回归模型方差分析

由表3可以看出，模型p值小于0.05，证明该模型方程存在显著性水平差异，其决定系数R2=0.941 6，这表明自变量和因变量之间存在显著的因果关系，其实际值与预测值之间的拟合度良好.分析结果表明，该模型可以预测和分析苦杏仁抗氧化肽的制备过程.

通过显著性分析可以看出，A和B均对响应值影响显著，且B的p值相较于A更小，可以说明对响应值的影响程度为：B>A>C，酶解温度的影响力更大，其次是底物蛋白的浓度，水解时间的影响程度最小.

2.3 工艺确定及优化验证

为了进一步确定最佳工艺，采用Design-expert12程序对酶解条件进行分析，可得到苦杏仁抗氧化肽的最佳提取方案为：底物蛋白浓度为9.444 mg·mL-1、酶解时间为1.921 h、酶解温度为51.607 ℃，此时DPPH自由基清除率为64.197%.结合实际操作，将其最佳提取参数修改为：酶解温度52 ℃、酶解时间115 min、底物蛋白浓度9 mg·mL-1.在这些条件下进行三组实验，测得平均提取率为64.9%，与理论最佳提取率相比，相对误差为0.71%.为了使实际操作更加简便，采用修改后的方法，具有很好的实用价值.

3 结论

实验以苦杏仁为原材料，以碱提酸沉法分离得到苦杏仁粗蛋白，以酶解法酶解得到苦杏仁多肽.在单因素实验基础上，用响应面试验对苦杏仁多肽的提取工艺进行优化，得到最佳工艺参数为：酶解温度52 ℃、酶解时间115 min、底物蛋白浓度9 mg·mL-1.在此最佳工艺条件下，苦杏仁蛋白酶解液DPPH自由基清除率可以达到64.9%.方差分析结果显示，对DPPH自由基清除率影响程度为：酶解温度>底物蛋白浓度>酶解时间.研究对苦杏仁抗氧化肽活性的优化提供理论参考，有助于中药苦杏仁的进一步开发利用.