加味阳和汤含药血清对MC3T3-E1与RAW264.7细胞共育体系的影响

杨智军 杨文龙 夏汉庭 李威罗云丰刘江源杨凤云*

1.江西中医药大学，江西 南昌 330004 2.江西中医药大学附属医院，江西 南昌 330006

骨质疏松症 (osteoporosis, OP) 是一种以骨量减少、骨强度下降、易发生脆性骨折为特征的代谢性疾病[1]。随着我国人口老龄化程度的不断加剧，OP患者逐年增加，已成为较常见的健康问题之一[2]。

骨重建过程中，破骨细胞(osteoclast, OC)介导的骨吸收大于成骨细胞(osteoblast, OB)的骨形成，两者的动态平衡被打破，骨量丢失过多，易发生OP[3-4]。OPG/RANKL/RANK信号通路对骨代谢的动态平衡发挥着重要作用，近年来被广泛用于OP的研究[5-8]。课题组前期体内实验[9]发现，加味阳和汤对OP肾阳虚证大鼠模型有较好治疗作用，但分子作用机制尚不明确。因此，本研究采用加味阳和汤含药血清与肾阳虚大鼠血清体外干预RAW264.7 和MC3T3-E1细胞共育体系，观察它们对护骨素(OPG)、核因子-κB(NF-κB)受体活化因子(RANK)、NF-κB受体活化因子配体(RANKL)蛋白表达的影响，探究此方对OP肾阳虚证的可能作用机制，为临床应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：选取2月龄SPF级雄性SD大鼠30只，由斯莱克景达实验动物有限公司提供，合格证号43004700062023。将大鼠随机分成加味阳和汤组和生理盐水组，每组15只。动物实验获得江西中医药大学动物实验伦理委员会批准。

1.1.2实验细胞：小鼠RAW264.7细胞株购自中科院细胞库(货号SCSP-5036)，小鼠MC3T3-E1 subclone 14细胞株购自赛百慷生物公司(货号iCell-m050)。

1.1.3主要药物：加味阳和汤由鹿角胶、熟地黄、鸡血藤等10味中药组成，每剂中药总量为100 g，购自江西省中医院。中药煎煮后，将药液蒸发浓缩至每毫升含生药1 g，保存于4 ℃。

1.1.4试剂：抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)检测试剂盒，碱性磷酸酶(ALP)显色试剂盒(碧云天生物研究所，批号P0332，C3206)；TRAP染色试剂盒(贝博公司，批号BB-44212)；一抗OPG，RANKL抗体(Bioss 公司，批号bs-0431R，bs-20647R)；一抗RANK抗体(ABclonal公司，批号A12997)；β-肌动蛋白(β-actin)抗体，细胞因子RANKL，M-CSF(Proteintech公司，批号51067-2-AP，315-11，315-02)。

1.2 方法

1.2.1加味阳和汤含药血清及肾阳虚大鼠血清的制备：依据参考文献[9]，按照体表面积换算公式，大鼠灌胃剂量为10 g/kg。连续灌胃7 d后采血，取上层血清，水浴灭活后保存于-20 ℃。课题组前期已制备肾阳虚大鼠血清，保存于-80 ℃[10]。

1.2.2小鼠MC3T3-E1和RAW264.7细胞的培养：将购买的两种细胞分别放于培养箱，根据细胞生长状态进行换液、传代及种板，ALP及茜素红染色评估MC3T3-E1细胞的成骨分化及矿化能力。此外，M-CSF、RANKL对RAW264.7细胞行破骨诱导，TRAP染色评估破骨分化能力。

1.2.3共育体系的建立及分组：依据参考文献[11]，于Transwell 培养板建立MC3T3-E1与 RAW264.7细胞共育体系，加入M-CSF、RANKL 共同培养。共培养4 d后，除空白组外，设置肾阳虚血清组、含药血清+肾阳虚血清组、含药血清组，分别干预共育体系48 h，进行相关指标检测。根据前期MTT和CCK-8实验结果[10,12]，各组血清质量分数均采用10 %。

1.2.4TRAP 及ALP活性的检测：按照 TRAP 和ALP检测试剂盒说明书分别进行相关步骤，计算样品TRAP和ALP活性[13]。

1.2.5TRAP 及ALP 染色：分别使用TRAP和ALP染色试剂盒进行，镜下随机抽取4个视野，计数TRAP 阳性细胞数目和观察ALP染色阳性细胞，采用Image J软件分析。

1.2.6WB检测OPG、RANKL及RANK蛋白表达：提取总蛋白，BCA 试剂盒检测蛋白浓度，依次制胶、上样、电泳、转膜及封闭，孵育一抗β-actin(1∶1 000)、OPG(1∶800)、RANKL(1∶800)及RANK(1∶1 000)，TBST 洗膜，孵育二抗(1∶5 000)，TBST再洗膜，ECL孵育，条带显影，Image Lab软件分析灰度值，计算目的与内参蛋白相对比。

1.3 统计学分析

2 结果

2. 1 小鼠MC3T3-E1细胞的形态观察及成骨分化、矿化染色

MC3T3-E1细胞在培养过程中，其形态多由圆形变为长梭形或多角形等，数量增多(图1a)。培养6 d后，ALP染色可见较多阳性细胞，胞质为蓝紫色(图1b)。此外，培养20 d后，茜素红染色见钙化结节形成，呈橘红色点状或片状分布(图1c、图1d)。这表明购买的MC3T3-E1细胞状态较好，可向OB分化。

注：a：MC3T3-E1细胞(×100) ; b：ALP染色(×100) ; c：茜素红染色(×200) ; d：茜素红染色(×200)。 图1 小鼠MC3T3-E1细胞的形态观察及成骨分化、矿化染色Fig.1 Morphological observation, osteogenic differentiation and mineralization staining of MC3T3-E1 cells

2. 2 小鼠RAW264.7细胞及破骨诱导的形态观察

RAW264.7细胞形态较小，多为圆形，呈集落状分布，增殖较快(图2a)。加入 RANKL及 M-CSF 诱导6 d后，镜下可见多核巨细胞形成(图2b)。TRAP染色可见阳性细胞，细胞核至少有3个及以上(图2c、图2d)。表明RAW264.7细胞状态稳定，可向OC分化。

注：a：RAW264.7细胞(×100); b：RAW264.7细胞(×200); c：Trap染色(×100); d：Trap染色(×200)。图2 小鼠RAW264.7细胞与破骨诱导的形态观察及染色Fig.2 Morphological observation and staining of mouse RAW264.7 cells and osteoclast induction

2. 3 对共育体系中TRAP、ALP 活性的影响

与空白组比较，肾阳虚血清组TRAP活性增加 (P<0.05)，ALP活性降低 (P<0.05)，而含药血清组TRAP活性降低(P<0.05)，ALP活性增加(P<0.05)。与肾阳虚血清组相比，含药血清+肾阳虚血清组TRAP活性降低(P<0.05)，ALP活性增加(P<0.05)。见表1。

表1 加味阳和汤含药血清对共育体系中TRAP、ALP 活性的影响

2. 4 对MC3T3-E1 细胞成骨分化的影响

对共育体系干预48 h后，观察MC3T3-E1细胞成骨分化情况，见图3。与空白组比较，肾阳虚血清组ALP染色阳性细胞及蓝紫色面积减少(P<0.05)，含药血清组蓝紫色面积增加(P<0.05)。与肾阳虚血清组相比，含药血清+肾阳虚血清组蓝紫色面积增加(P<0.05)。见表2。

2. 5 对RAW264.7细胞破骨分化的影响

干预48 h后，观察RAW264.7细胞的破骨分化情况，见图4。与空白组比较，肾阳虚血清组OC数目增加(P<0.05)，含药血清组OC数目减少(P<0.05)。与肾阳虚血清组相比，含药血清+肾阳虚血清组OC数量减少(P<0.05)。见表3。

注：A：肾阳虚血清组; B：空白组; C：含药血清+肾阳虚血清组; D：含药血清组。图4 加味阳和汤含药血清对RAW264.7细胞破骨分化的TRAP染色(×40)Fig.4 TRAP staining of RAW264.7 cell osteoclast differentiation with serum containing Jiawei Yanghe Decoction (×40)

表3 加味阳和汤含药血清对RAW264.7细胞破骨分化的影响

2. 6 对成骨细胞 OPG、RANKL蛋白表达的影响

与空白组比较，肾阳虚血清组RANKL蛋白表达增加(P<0.05)，OPG蛋白表达降低(P<0.05)，而含药血清组RANKL蛋白表达降低(P<0.05)，OPG蛋白表达增加(P<0.05)。与肾阳虚血清组比较，含药血清+肾阳虚血清组RANKL蛋白表达降低(P<0.05)，OPG蛋白表达增加(P<0. 05)。见图5，表4。

表4 加味阳和汤含药血清对OPG 、RANKL及RANK蛋白表达的影响

注：A：肾阳虚血清组; B：空白组; C：含药血清+肾阳虚血清组; D：含药血清组。图5 加味阳和汤含药血清对成骨细胞 OPG、RANKL蛋白表达的影响Fig.5 The effect of serum containing Jiawei Yanghe Decoction on the expression of OPG and RANKL proteins in osteoblasts

2. 7 对RAW264.7及破骨细胞RANK蛋白表达的影响

与空白组比较，肾阳虚血清组RANK蛋白表达增加(P<0.05)，含药血清组RANK蛋白表达降低(P<0.05)。与肾阳虚血清组比较，含药血清+肾阳虚血清组RANK蛋白表达降低(P<0.05)。见图6，表4。

注：A：肾阳虚血清组; B：空白组; C：含药血清+肾阳虚血清组; D：含药血清组。图6 加味阳和汤含药血清对RAW264.7及破骨细胞RANK蛋白表达的影响Fig.6 The effect of serum containing Jiawei Yanghe Decoction on the expression of RAW264.7 and osteoclast RANK protein

3 讨论

中医认为OP多与肾阳不足、肝肾亏虚、血瘀气滞等有关[14]。加味阳和汤由鹿角胶、熟地黄、肉桂、鸡血藤等中药配伍而成[15]，全方有温补肾阳、填精益髓、活血化瘀之功效，临床上用于OP肾阳虚证疗效较好。

前期体内实验[9]也表明，加味阳和汤可改善OP肾阳虚证大鼠模型的骨密度。为进一步探究此方抗OP的分子作用机制，本研究予含药血清体外干预RAW264.7与MC3T3-E1细胞共育体系。

RAW264.7细胞属于OC前体细胞[16]，MC3T3-E1 subclone 14细胞属于OB前体细胞[17]。与单独培育RAW264.7或MC3T3-E1细胞相比，共育体系可更好模拟机体骨代谢微环境。

前期研究[10]还发现，肾阳虚大鼠血清可下调共育体系中OPG 蛋白表达，上调RANKL 蛋白表达。因此，本研究设置肾阳虚血清组和含药血清+肾阳虚血清组，观察含药血清能否改善肾阳虚大鼠血清对共育体系的影响。

研究结果表明，与肾阳虚血清组相比，含药血清+肾阳虚血清组可增加OPG并降低RANKL、RANK蛋白表达，抑制破骨分化，促进骨形成。这在一定程度上证实了加味阳和汤对OP肾阳虚证的作用，为临床运用提供了相关药理学依据。但中药复方成分复杂，此方对OP肾阳虚证的治疗机制可能涉及其他靶点和途径，均需课题组今后深入探究。