超微联合超声波优化提取米糠蛋白及其对米糠蛋白溶解性的影响

2022-10-18 04:51易佳刘昆仑
食品研究与开发 2022年19期
关键词:米糠超声波功率

易佳,刘昆仑

(河南工业大学粮油食品学院,河南 郑州 450001)

米糠是糙米加工的主要副产物(占稻谷的10%),产量高,具有一定的营养价值,但其利用率低,多被用作饲料处理,造成了米糠资源浪费[1-2]。米糠蛋白在米糠营养物质中占13%~18%,富含限制性氨基酸(赖氨酸),是一种优质的谷物蛋白[3]。米糠蛋白具有氨基酸组成合理、生物效价高及消化率高等优点[4]。此外,米糠蛋白还具有低过敏性,可适用于易过敏人群及婴幼儿。因此,充分提取米糠蛋白是改善米糠资源浪费、提高米糠资源利用率的有效途径。

米糠蛋白中的二硫键使蛋白质发生高度聚合,从而导致米糠蛋白提取率低、溶解性差[5],在食品应用方面受限制。提取米糠蛋白的方法主要有物理法、碱法、酶法等[6]。碱法会导致蛋白质氨基酸之间反应生成有毒物质或变性;酶法会破坏米糠蛋白的天然结构,从而影响其功能特性。相比于以上两种方法,物理法提取具有减小米糠颗粒、打破米糠细胞结构、维持米糠蛋白功能特性,且不引起蛋白质变性等优点,更适用于工业生产。研究发现,超微粉碎能快速、高效地粉碎物料,保持物料原有的理化特性和活性物质。相关研究表明,与普通粉碎相比,经超微粉碎的酸枣仁蛋白质提取率由69.71%提高至76.56%[7-8]。Bedin等[9]对比碱提、超声波辅助碱提等方法,发现超声波辅助提取能在较短时间内获得较高米糠蛋白提取率,且杂质少,对米糠蛋白结构破坏小。超声波能产生高剪切力,破坏米糠细胞结构[10],增大米糠蛋白分子运动频率和速度;超微粉碎能减小米糠颗粒、打破米糠结构,提高米糠资源利用率[11];研究表明[12-14]联合两种物理方法较单一物理法更能提高蛋白质的提取率。

目前,超声波和超微粉碎已广泛应用于活性物质的提取,但两者联合作用提取米糠蛋白的报道较少。因此,为了提高米糠蛋白的提取率、加深米糠资源的利用率,本研究联合超微粉碎和超声波提取米糠蛋白,并采用响应面法对米糠蛋白提取工艺进行优化,确定米糠蛋白的高效提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜米糠:原阳县八素米业有限公司;正己烷、盐酸、氢氧化钠、硫酸(均为分析纯):四川西陇科学有限公司;考马斯亮蓝G-250:上海蓝季科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

WF-18小型超微粉碎机:温州顶历医疗器械有限公司;JY92-IIN超声波细胞粉碎机(变幅杆型号Φ10):宁波新芝生物科技股份有限公司;Kjeltec 8400全自动凯式定氮仪:丹麦福斯公司;UV1800PC紫外可见分光光度计:上海菁华科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 米糠基本成分的测定

分别参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》、GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》、GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》和GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》测定米糠中的水分、灰分、蛋白质和脂肪。

1.3.2 脱脂米糠的制备

新鲜米糠经超微粉碎后,以1∶10(g/mL)的料液比加入正己烷,在(25±2)℃下对米糠进行振荡脱脂3 h,重复3次,静置30 min。上清液通过旋转蒸发回收正己烷,沉淀于通风橱晾干10 h,于-20℃密封保存。

1.3.3 米糠蛋白提取工艺流程

脱脂米糠→以一定料液比加入去离子水→以一定条件(超声功率、超声时间)进行超声波处理(固定超声间歇时间:2、2 s)→调节pH值至9.5→50℃水浴搅拌→5 000 r/min离心30 min→收集上清液,定容→测定上清液中蛋白质含量,计算提取率→酸沉,调节pH值为4.5→冷冻干燥→-20℃贮藏、备用。

1.3.4 米糠蛋白提取率的测定

采用GB 5009.5—2016中的凯式定氮法测定蛋白质含量,米糠蛋白提取率按公式(1)计算。

1.3.5 单因素试验

选择料液比 [1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60(g/mL)]、超声功率(65、130、195、260、325 W)、超声时间(4、8、12、16、20 min)和提取时间(1、2、3、4、5 h)进行单因素试验,探究各因素对米糠蛋白提取率的影响。

1.3.6 响应面优化试验

选取料液比、提取时间和超声时间为优化因素,利用响应面法优化米糠蛋白提取工艺。保持超声功率为130 W,以米糠蛋白提取率为响应值,采用Box-Behnken设计进行试验。因素水平见表1。

表1 响应面因素水平Table 1 Response surface factor level

1.3.7 蛋白质溶解度

配制10 mg/mL的米糠蛋白溶液(以pH7.0的磷酸缓冲液配制),(25±2)℃下振荡 30 min,离心 10 min(4 000 r/min),取上清液,经考马斯亮蓝G-250染色后,测定可溶性蛋白质量[15],溶解度根据公式(2)计算。

1.3.8 数据处理

所有试验重复3次,取平均值。采用SPSS 23.0进行显著性分析(P<0.05),Design-Expert 10.0.1进行响应面设计、方差分析及预测。

2 结果与分析

2.1 米糠基本成分测定结果

米糠基本成分测定结果见表2。

表2 基本成分的测定Table 2 Determination of basic components

如表2所示,原料米糠中水分、灰分、蛋白质和脂肪分别为10.68%、9.56%、13.68%和21.36%。

2.2 单因素试验

2.2.1 料液比对米糠蛋白提取率的影响

料液比对米糠蛋白提取率的影响,结果见图1。

图1 料液比对米糠蛋白提取率的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of rice bran protein

由图1可知,当溶剂用量较少时,反应体系因淀粉及纤维素等物质[16]吸水膨胀变黏稠,导致流动性变差,蛋白分子扩散变慢,米糠蛋白无法充分溶出,从而降低了蛋白提取率;当料液比为1∶50(g/mL)时,反应体系黏度降低、物料流动性增强且充分扩散[17],增加了溶液中物质的传质速度,从而提高了米糠蛋白的提取率;但继续增加溶剂用量时,其他非蛋白物质溶出[18],阻碍了米糠蛋白的溶出,从而导致蛋白提取率降低。因此,提取工艺最佳料液比确定为1∶50(g/mL)。

2.2.2 超声功率对米糠蛋白提取率的影响

超声功率对米糠蛋白提取率的影响见图2。

图2 超声功率对米糠蛋白提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on extraction rate of rice bran protein

由图2可知,当超声功率增加至130 W时,超声波的空化效应破坏了米糠细胞,加快了传质速度,促进了细胞内容物溶出,增大了物质和液体之间的接触面,从而进一步提高了米糠蛋白提取率[19-20];超声功率继续增加,过强的剪切力破坏了米糠蛋白的高级结构[10,21],且反应体系温度升高,米糠中淀粉发生糊化,使蛋白质溶出受到阻碍,从而导致米糠蛋白提取率下降。因此,提取工艺最佳超声功率确定为130 W。

2.2.3 超声时间对米糠蛋白提取率的影响

超声时间对米糠蛋白提取率的影响见图3。

图3 超声时间对米糠蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction rate of rice bran protein

由图3可知,米糠蛋白提取率随超声时间的延长有明显变化。在料液比为1∶50(g/mL)、超声功率为130 W的条件下,当超声时间延长至12 min时,超声波的空化效应逐渐增强,使米糠蛋白与淀粉、纤维素等结合物分离[22],且空化气泡破裂所产生的压力使米糠结构变得疏松[10],引入了大量溶剂,增大了细胞内物质与溶剂的接触面,促进了米糠蛋白的溶出;而当超声时间过长时,超声所伴随的热量过高,使米糠蛋白发生变性[22],导致米糠蛋白提取率下降。因此,提取工艺最佳超声时间确定为12 min。

2.2.4 提取时间对米糠蛋白提取率的影响

提取时间对米糠蛋白提取率的影响见图4。

图4 提取时间对米糠蛋白提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of rice bran protein

在料液比1∶50(g/mL)、超声功率130 W及超声时间12 min的条件下,提取时间对米糠蛋白提取率有明显影响。由图4可知,当提取时间较短时(1h~2 h),米糠蛋白与其结合物的分离程度较小[23],导致提取率较低;随着提取时间增至4 h,长时间地浸泡使米糠结构变疏松,米糠蛋白大量溶出,导致米糠蛋白提取率逐渐上升;但当提取时间超过4 h时,米糠蛋白因其高聚合活性发生聚集沉淀[18,24],进而导致米糠蛋白提取率降低。因此,提取工艺最佳提取时间确定为4 h。

2.3 响应面试验及结果分析

根据单因素试验,选择料液比、超声时间及提取时间进行响应面Box-Behnken优化试验,其中固定超声功率为130 W,以米糠蛋白提取率为优化指标。试验设计及结果见表3,方差分析见表4。

表3 试验设计及结果Table 3 Test design and results

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

利用软件Design-Expert 10.0.1对试验数据进行方差分析,得到拟合后的二次多项回归方程为Y=63.20+0.70X1-0.059X2-0.57X3+0.52X1X2-0.30X1X3+0.43X2X3-0.99X12-1.67X22-0.37X32。由表4可知,该回归模型极显著(P<0.0001),且模型的相关系数R2=0.9827,R2adj=0.960 5,说明该模型置信度高。因此,超微超声辅助提取工艺可用该模型进行分析和预测。根据F值的大小可以判断出各因素对米糠蛋白提取率的影响程度:X1>X3>X2,即料液比>超声时间>提取时间。根据 P值可以看出,X1、X3影响极显著(P<0.01),X2影响不显著(P>0.05);X1和X2的交互作用对Y值的影响极显著(P<0.01),X2和 X3的交互作用显著(P<0.05),而 X1和X3的交互作用不显著(P>0.05),可能是由于因素的主效应大于因素间的相互作用。

图5是各因素影响米糠蛋白提取率的直观反映。根据响应曲面坡度及等高线密度可判断交互作用是否显著,坡度越陡、密度越密,交互作用越显著。

图5 各因素交互作用响应面Fig.5 Response surface of interaction of factors

由图5可知,料液比和提取时间、提取时间和超声时间的交互作用显著,料液比和超声时间的交互作用不显著,其结论与方差分析相符。

2.4 最佳工艺条件的确定及验证

对该回归模型进行计算,得最佳提取工艺为料液比1∶56.52(g/mL)、提取时间 4.06h、超声时间9.28min。根据实际可操作性,修改工艺参数为料液比1∶57(g/mL)、提取时间4 h、超声时间9 min。经多次验证试验,米糠蛋白提取率为(64.31±0.18)%,与预测结果63.58%接近。说明该回归模型能准确预测试验结果。因此,确定最佳工艺参数为料液比1∶57(g/mL)、提取时间4 h、超声时间9 min。

2.5 提取方法比较

将超微联合超声提取与传统碱溶酸沉提取的米糠蛋白进行比较,以蛋白提取率、蛋白纯度和蛋白溶解度为比较参数,结果如图6所示。

由图6可知,经超微联合超声提取,米糠蛋白提取率有极显著提升,由传统碱溶酸沉提取的45.41%提升到64.31%,提高了41.62%。超微粉碎减小了米糠粒径,增大了米糠与碱液的接触面,使得米糠蛋白更易提取;同时由于超声波的空化效应加快了米糠混合液的传质速度,加速了米糠蛋白的溶出,并且破坏了米糠蛋白与其他非蛋白物质的聚集体,使得酸沉下来的蛋白质纯度升高。进一步研究发现,经超微联合超声提取的米糠蛋白溶解度为25.49%,相比碱溶酸沉法有明显提升。

3 结论

研究发现经超微联合超声提取能有效提高米糠蛋白的提取率。通过单因素试验和响应面优化后,得到最佳提取工艺:料液比 1∶57(g/mL)、提取时间4 h、超声时间9min。最终米糠蛋白提取率为(64.31±0.18)%。进一步研究发现,经超微联合超声提取后,米糠蛋白的提取率、纯度及溶解度较传统碱溶酸沉提取有所提高。本研究有效提高了米糠蛋白的提取率,同时发现经此提取,其溶解度有所改善,后续将对米糠蛋白的增溶工艺进行探究,为米糠蛋白质资源的精加工及利用提供参考。

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