核酸试纸条快速检测蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因方法的建立

贾慧建,李昊宇,王 丹,姜菲菲,赵潇颖,董婧瑶,孙丽媛

（1.北华大学医学技术学院分子生物教研室，吉林 吉林 132013；2.山东省聊城市人民医院检验科，山东 聊城 252000；3.中国铁路沈阳局集团有限公司吉林疾病预防控制所，吉林 吉林 132001）

蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）是一种能形成芽胞的革兰阳性需氧菌或兼性厌氧菌，其菌体细长直或稍弯曲，末端呈方形，大小为（1.0～1.3）μm×（3.0～5.0）μm，可形成链状。在甘露醇卵黄多黏菌素琼脂培养基（mannitol egg yolk polymyxine agar，MYP）琼脂平板上典型菌落为不发酵甘露醇的微粉红色菌落，可产生卵磷脂酶，菌落周围有白色至淡粉红色沉淀环［1］。蜡样芽胞杆菌是常见的食源性致病菌，根据其引起食物中毒的症状可分为致呕吐型肠毒素和致腹泻型肠毒素［2］。其中编码相关毒素的毒力基因主要为肠毒素基因（entFM）、细胞毒素基因（cytK）、溶血性基因（hbl）、非溶血性基因（nhe）和呕吐毒素基因（ces）［3］。

entFM现已被鉴定为一种细胞壁肽酶，并被重新命名为CwpFM［4］。尽管CwpFM对上皮细胞和巨噬细胞均无直接细胞毒性，但其诱导巨噬细胞空泡化，诱导蜡样芽胞杆菌的毒力产生［5］。研究［6-8］显示：entFM毒素基因携带率较高，在婴幼儿奶粉和米粉中均有检出，是导致婴幼儿和抵抗力差人群感染的潜在致病因素。目前，蜡样芽胞杆菌毒素的检测方法主要包括质谱法、免疫学法和分子生物学法［9］。针对entFM的检测方法主要为分子生物学法，其他检测方法鲜有报道。FORGHANI等［10］开发了一种高灵敏度的多重反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）高分辨率熔解曲线检测方法，用于同时检测4种主要的毒素基因（cytK、entFM、hblD和nheA）和呕吐毒素基因ces，但该方法需采用费力、耗时和低分辨率的凝胶电泳检测PCR产物。核酸试纸条摆脱了凝胶电泳可视化观察结果，本研究采用核酸试纸条的方法检测entFM毒素相关合成基因，方法简单，可快速诊断蜡样芽胞杆菌感染患者，并可应用于食品安全、基层诊断和流行性病学调查等方面。

1 材料与方法

1.1 细菌、主要试剂和仪器ATCC11778蜡样芽胞杆菌标准菌株（广东环凯微生物有限公司），大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和沙门氏菌等其他菌株均为北华大学医学技术学院分子生物教研室保存菌种。100 bp DNA Marker和2×Taq PCR Master Mix［天根生化科技（北京）有限公司］，生物素化牛血清白蛋白（北京博尔西科技有限公司），链霉亲和素（北京环球兴达生物科技有限公司），兔抗FITC多克隆抗体［生工生物工程（上海）股份有限公司］，胶体金（上海华蓝化学科技有限公司），牛血清白蛋白（上海碧云天生物技术有限公司），试纸条快速诊断整合方案（上海杰一生物技术有限公司），其他试剂均为国产分析纯。多功能梯度PCR仪TC9600-G（美国Labnet公司），通用型电泳仪JY300E（北京君意东方电泳设备有限公司），紫外凝胶成像分析仪UV WHITE-2020D（美国BioRad公司），微量核酸蛋白测定仪NanoDrop One（美国Thermo公司）。

1.2 蜡样芽胞杆菌DNA提取采用煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA，将待测菌株由培养基挑取2～3个菌落，加入至500 μL生理盐水中研磨，金属浴100℃煮沸10 min。12 000 r·min－1离心10 min，取EP管中上清液，分装备用。

1.3 蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因PCR引物设计和产物鉴定GenBank数据库中查找蜡样芽胞杆菌entFM毒素的基因序列，利用NCBI-BLAST设计引 物：上 游 引 物5′-GTGGCAAAACAGGAACGACT-3′，下 游 引 物5′-CTCCACCGATTACAGCGTTG-3′。分别于5′端标记异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）和生物素（Biotin），并由宝生物工程（大连）有限公司合成。

PCR反 应 体 系：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，双蒸水8 μL。

PCR反应参数：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物检测：6 μL PCR产 物1.5%琼 脂 糖 凝 胶，85 V电泳85 min。紫外凝胶成像仪观察检测结果，entFM毒素基因于363 bp处出现目的条带即为阳性结果。

entFM363毒素特异性基因片段克隆，克隆后的基因序列结果经NCBI-Nucleotide BLAST分析，与GenBank数据库中已登记的序列进行比对验证，分析PCR产物。采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化PCR产物并测量回收DNA的浓度，pGM-T连接试剂盒将pGM-T载体和产物DNA连接，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据蓝白斑筛选阳性菌克隆。LB液体培养基增菌后，质粒小提试剂盒提取质粒DNA，检测质粒DNA浓度，以质粒DNA为模板进行PCR扩增，紫外凝胶成像仪观察。分装提取后的质粒DNA，由生工生物工程（上海）股份有限公司测序分析比对。采用微量核酸蛋白测定仪检测基因DNA浓度和吸光度（A）值，计算A（260）/A（280），每个样品检测3次，取平均值，以A（260）/A（280）比值代表DNA纯度。

1.4 核酸试纸条设计原理［11］及鉴定采用核酸试纸条检测样品时，需将PCR产物和待测样品分别添加至样品垫，由于液体毛细作用向前流动，当有扩增产物时，扩增产物一端标记的生物素会先与胶体金修饰的链霉亲和素结合，到达检测线后扩增产物另一端修饰的FITC与检测线上标记的兔抗FITC抗体结合，形成类似于酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）中的双抗体夹心，从而使检测线显色。剩余的胶体金修饰链霉亲和素与质控线上的生物素化牛血清白蛋白结合，使质控线显色。当无扩增产物时，检测线胶体金修饰的链霉亲和素无法与检测线兔抗FITC抗体结合则不显色，但可与质控线生物素化牛血清白蛋白结合从而显色。见图1。

图1 核酸试纸条原理Fig.1 Principle of nucleic acid test strip

分别将已标记的PCR引物和未标记的PCR引物混合反应，验证核酸试纸条原理。实验分为以全标记的引物组（全标记组）、以上游引物5′端标记的FITC和下游未标记的引物组（FITC标记组）、以上游未标记的引物和5′端标记生物素的下游引物组（生物素标记组）和全部未标记的引物组（未标记组）。预期仅全标记组显色。

1.5 链霉亲和素最佳标记量和抗体工作浓度确定采用0.1 mmol·L－1碳酸钾调整胶合金pH值为最适pH值7.0，并分别取100 μL胶体金置于EP管中。分别加入1 g·L－1待标记的链霉亲和素0、1、2、3、4、5和6 μL，摇晃混匀，室温混合20 min后，各组分别加入10%生理盐水，静置2 h，观察胶体金颜色变化，按照参考文献［12］方法，采用胶体金标记链霉亲和素。

兔抗FITC抗体和生物素化牛血清白蛋白稀释后分别划于硝酸纤维素上，形成质控线与检测线，37℃烘干，根据实验结果确定2种抗体的工作浓度。

1.6 核酸试纸条检测将裁剪后的PVC底板、标记C和T线的硝酸纤维素膜、胶体金垫、吸水垫和样品垫组装。检测样品时将PCR产物6 μL和样品展开液90 μL依次加入样品垫后，10 min后观察检测结果。C、T线同时出现红色条带为阳性结果；C线出现红色条带，T线未出现红色条带为阴性结果；其他结果为无效结果。

1.7 核酸试纸条灵敏度试验将蜡样芽胞杆菌DNA模板双蒸水稀释，制备10～10－5mg·L－1梯度混悬液。各组PCR体系含DNA模板（10～10－5mg·L－1）0.5 μL、PCR引物1 μL、2×Taq PCR Master Mix 10 μL和双蒸水8 μL。进行PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果比对分析核酸试纸条灵敏度。

1.8 核酸试纸条特异性试验根据蜡样芽胞杆菌的DNA提取方法分别提取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌和沙门氏菌DNA，并分别稀释至10 mg·L－1。制备DNA混合液（含各菌种DNA各1 μL），彻底混匀后进行PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果进行比对分析核酸试纸条特异性。

1.9 核酸试纸条稳定性试验完成试纸条组装后，配制检测试剂并保存。分别于组装后第6、9和12个月检测核酸试纸条稳定性，进行PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果分析核酸试纸条稳定性。

2 结 果

2.1 蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因PCR产物鉴定检测提取的蜡样芽胞杆菌DNA浓度为300 mg·L－1，DNA纯度约为1.60。见表1。琼脂糖凝胶电泳结果显示：电泳图中1～2号泳道依次出现蜡样芽胞杆菌大小目的条带，且质粒壳完好，条带明显，证明PCR产物DNA成功转入质粒，并成功提取质粒DNA。见图2。基因测序结果显示：蜡样芽胞杆菌DNA序列分别与GenBank数据库中已登记的蜡样芽胞杆菌entFM毒素基因相似性为100%，表明克隆DNA片段即为目的基因片段，可作为阳性质粒。见图3。

图3 entFM363目的基因序列分析结果Fig.3 Analysis results of sequence of target gene of entFM363

表1 蜡样芽胞杆菌DNA浓度和纯度Tab.1 Concentrations and purities of Bacillus cereus DNA(n=3，±s）

表1 蜡样芽胞杆菌DNA浓度和纯度Tab.1 Concentrations and purities of Bacillus cereus DNA(n=3，±s）

Sample 1 2 3 Concentration[ρB/（mg·L－1）]337.79±0.14 345.64±1.54 362.43±0.45 Purity 1.62±0.12 1.64±0.13 1.66±0.16

图2 蜡样芽胞杆菌entFM基因表达电泳图Fig.2 Electrophoregram of expression of entFM gene of Bacillus cereus

2.2 链霉亲和素最佳标记量和抗体工作浓度胶体金与链霉亲和素的结合实质上是静电结合，高浓度盐会使不稳定的胶体金聚合沉淀变色。N管添加了高浓度的盐作为对比，检测结果显示：1 g·L－1链霉亲和素的最佳标记量为3 μg，为介于紫色和粉红色的过渡色。但实际标记量要增加10%，即3.3 μg。

兔抗FITC抗体浓度为1.8 g·L－1和生物素化牛血清白蛋白浓度为1 g·L－1时，硝酸纤维素膜上检测线和质控线均可产生较为清晰的条带。

2.3 核酸试纸条检测核酸试纸条检测时仅PCR产物两端形成FITC-生物素结合物时才会发生显色反应。各组引物PCR产物核酸试纸条结果显示：仅有全标记组核酸试纸条显色，表明核酸试纸条设计原理验证成功。见图4。

图4 核酸试纸条设计原理检测Fig.4 Detection design principle of nucleic acid test strips

2.4 核酸试纸条灵敏度电泳结果显示：DNA模板浓度同时稀释至10－1mg·L－1时，仍可观察到目的条 带，最 低 检 测 浓 度 为10－1mg·L－1。稀 释 至10－3mg·L－1可见检测线和质控线同时出现2条清晰可见的红色条带，为阳性结果，核酸试纸条的最低检测浓度为10－3mg·L－1，表明本研究核酸试纸条结果较普通PCR灵敏性高100倍。见图5和6。

图5 核酸试纸条灵敏度检测电泳图Fig.5 Electrophoregram of sensitivities of nucleic acid test strips

2.5 核酸试纸条特异性PCR电泳结果显示：仅蜡样芽胞杆菌出现了目的条带，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门氏菌和空白对照无目的条带出现，为阴性结果。核酸试纸条的特异性检测结果显示：仅蜡样芽胞杆菌的检测线和质控线均出现红色条带，为阳性结果。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门氏菌和空白对照的核酸试纸条中，仅在质控线（C线）出现红色条带，在检测线（T线）无红色条带，为阴性结果。PCR电泳结果与核酸试纸条结果一致。见图7和8。

图7 核酸试纸条特异性检测电泳图Fig.7 Electrophoregram of specificities of nucleic acid test strips

图6 核酸试纸条灵敏度Fig.6 Sensitivities of nucleic acid test strips

2.6 核酸试纸条稳定性组装后核酸试纸条稳定性检测结果显示：在第6、9和12个月进行核酸试纸条稳定性检测结果一致，仅蜡样芽胞杆菌的菌株出现阳性结果，即质控线（C线）和检测线（T线）2条红色条带；空白对照为阴性结果，即只出现质控线（C线）1条红色条带。见图9。

图9 核酸试纸条稳定性Fig.9 Stabilities of nucleic acid test strips

3 讨 论

目前蜡样芽胞杆菌的检测方法主要为培养法，其可靠性较高，且相对简单、设备要求低，是多种微生物检验的金标准。尽管细菌培养分离鉴定法应用十分广泛，但也存在检测过程繁琐和耗时较长等不足，同时无法检测毒素的存在。戚衍博等［13］利用动物实验腹腔注射检测产呕吐毒素较为直观，但具有半定性且不够准确，费用较高；TSILIA等［14］采用质谱方法直接检测毒素蛋白，并使用特征m/z光谱位置来鉴定不同蜡样芽胞杆菌培养上清液中CytK1和NHe蛋白，但该方法需要依靠尖端设备、较高的投资和维护［15-17］。

图8 核酸试纸条特异性Fig.8 Specificities of nucleic acid test strips

核酸试纸条因其特异性强、灵敏度高、可视化和更适合检测人员现场检测的特点得到广泛应用。张力支等［18］基于纳米金核酸探针的新型核酸试纸条对灿烂弧菌快速检测，该试纸条与5种常见水产病原菌不发生阳性反应，特异性强；王之莹等［19］利用侧流核酸试纸条快速检测非洲猪瘟病毒，应用于实际样品的检测，灵敏度可达103copies·μL－1，灵敏度高；QIN等［20］基于侧流条带平台可在2 h内快速、方便地对鸭肉掺假牛肉进行可视化鉴别，适合资源有限的环境和现场检测中的应用。核酸检测试纸条应用到蜡样芽胞杆菌毒素基因检测，能够为检查人员的现场诊断提供更准确便捷的检测手段。

entFM是一种主要的蜡样双歧杆菌毒素，参与细菌分裂、真核细胞的黏附及促进其毒力作用，在从不同食物基质分离的蜡样芽胞杆菌中广泛分布，检出率为68%～98%，与食源性疾病相关的菌株中均可检测到［21-25］。本研究以蜡样芽胞杆菌特异性毒素基因为研究对象，以基因为靶标构建核酸试纸条方法检测蜡样芽胞杆菌毒素基因，煮沸法提取其基因组DNA，通过克隆完成PCR产物的鉴定并可作为阳性对照。本研究结果显示：组装后的核酸试纸条与金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌和沙门氏菌均不发生反应，特异性强，其最低检测浓度为10－3mg·L－1，比普通PCR灵敏度高100倍，且于第6、9和12个月检测稳定性结果一致，稳定性强。检测时只需在核酸试纸条的样品垫上滴加6 μL的PCR产物与90 μL样品展开液，10 min观察结果，即可实现entFM毒素基因核酸可视化和特异性检测。随着等温扩增PCR技术的兴起，将其与核酸试纸条相结合，为未来快速检测蜡样芽胞杆菌提供新的方向。