阿尔茨海默病脑TAU蛋白磷酸化位点综述

刘 硕综述， 曹云鹏审校

阿尔茨海默氏病(AD)是痴呆中最典型的疾病，占所有痴呆病例的50%至60%[1]。AD的典型病理标志是神经元内神经原纤维缠结(NFT)和细胞外的淀粉样斑块(SP)沉积[2]。1988年，克劳德·维希克从AD患者大脑的斑块中分离出TAU，首次证明TAU可能是痴呆症的病因[3]。

TAU是神经元主要的微管相关蛋白，位于与微管相关的神经元轴突，可促进微管的组装以及稳定微管的结构[4]。TAU由17号染色体单基因编码，由于其前体基因的外显子2、3、10的选择性剪接，在成人大脑中表达为六种同工型，分别为2N4R(TAU441)、1N4R(TAU412)、0N4R(TAU383)、2N3R(TAU410)、1N3R(TAU381)和0N3R(TAU352)，人类胎儿的大脑仅表达0N3R亚型[5]。根据序列和功能特性，可将TAU分为四个区域：NTR(N末端区域)、PRR(富含脯氨酸区域)、MBR(微管结合区域)以及CTR(C末端区域)[6]。

TAU是一种磷蛋白，正常低水平的磷酸化才能使TAU发挥最佳功能，而高水平异常磷酸化的TAU则失去其生物学活性[7]。Herrmann等用ELISA测定快速尸解的AD与同年龄正常人的脑组织匀浆，表明 AD组的额叶皮层、顶叶皮层和海马的TAU磷酸化水平明显增加，其中海马最高，但在小脑中未观察到差异[8]。在正常的人脑中，每摩尔TAU含有2～3 mol磷酸盐，且负面调节TAU与微管的结合，而在AD脑中，TAU被3～4倍过度磷酸化，每摩尔TAU含有8 mol磷酸盐，磷酸化水平达到饱和[9]，并聚成神经原纤维缠结(NFT)[10]。NFT计数与TAU磷酸化水平正相关[8]。TAU的C末端区域的高水平磷酸化可能是其自聚集为NFT的原因[11]。NFT结构中有大量异常的双股螺旋纤维(PHF)，成束密集排列，富含超磷酸的TAU[12]。认知障碍在经典缠结形成之前发生，TAU过度磷酸化可能是AD认知障碍的风险机制[13]。

1 AD患者TAU磷酸化位点

在由441个氨基酸组成的最长的人类TAU亚型中，总共有85个可磷酸化位点，其中45个丝氨酸残基，35个苏氨酸残基和5个酪氨酸残基，分别占TAU可磷酸化残基的53%、41%和6%[14]，5个酪氨酸残基为Tyr18，Tyr29，Tyr197，Tyr310，Tyr394[15]。单个TAU分子不可能在所有这些位点都被磷酸化，PHF中 TAU至少在37个丝氨酸/苏氨酸残基位点及2个酪氨酸残基位点磷酸化，包括：Thr-39、Ser-46、Thr-69、Thr-123、Ser-137、Thr-153、Thr-175、Thr-181、Ser-198、Ser-199、Ser-202、Thr-205、Ser-208、Ser-210、Thr-212、Ser-214、Thr-217、Thr-231、Ser-235、Ser-237、Ser-238、Ser241、Ser-262、Ser-285、Ser-305、Ser-324、Ser-352、Ser-356、Ser-396、Ser-400、Thr-403、Ser-404、Ser-409、Ser-411、Ser-412、Ser-413、Ser-416、Ser-422、Thr-427、Ser-433、Ser-435[7]以及Ser-68、Thr-71、Ser-113、Ser-184、Ser-185、Ser-191、Tyr-197、Ser-258、Tyr-394、Thr-427、Ser-433、Ser-435[16]。其中最主要的十个超磷酸化位点是Ser198，Ser199，Ser202，Thr231，Ser235，Ser396，Ser404，Ser409，Ser413和Ser422[17]，Ser404磷酸化程度最高[18]。在AD大脑中，TAU过度磷酸化会诱导恶性循环，促进TAU病理在脑中的传播以及在人脑脊液(CSF)中的积累[19]。Russell及Mitra等通过质谱法对CSF中的磷酸化TAU分析表明，与正常人脑对照组相比，AD患者的CSF中一些位点磷酸化明显增加(见表1)。但AD患者CSF Ser202磷酸化程度却较正常人低[18]。

在AD早期磷酸化程度就升高的位点：Thr181，Ser199，Thr205和Ser404[20]Thr217，Ser262，Thr231、Ser396、Thr212[21，22]，其中TAU的Ser199残基在AD发展的早期和晚期均异常过度磷酸化[23]，Thr231的磷酸化程度随AD的发展而降低[24]。Ser202、Thr205、Ser409和Ser422磷酸化程度升高发生在NFT后期[25]。

异常高磷酸化的TAU可以隔离正常TAU与微管，进一步破坏微管动力学，但需要多个位点同时磷酸化才能破坏TAU与微管之间的相互作用[26]。Thr212，Ser214，Thr231，Ser235和Ser262，是抑制TAU结合微管的主要位点，Ser262、Thr231、Ser 235处磷酸化大大降低了Tau与微管结合的能力分别降低了33%、26%和9%，导致微管不稳定[27]；在AD神经退行性变早期，Thr212，Thr231和Ser262这三个磷酸化升高位点的组合将TAU转化为毒性分子，导致微管网络的破坏和细胞死亡[22]；磷酸化的Thr231是对去磷酸化具有异常抵抗力的残基[26]，磷酸化水平升高可预测轻度认知障碍患者向AD转化[28]；磷酸化Thr181是CSF中公认的AD核心生物标志物[29]；TAU在Ser396和Ser404处的磷酸化增加通过从微管中分离正常TAU分子而损害微管组装，在体外产生更多的原纤维形式TAU，聚集增加[1]；Ser202、Thr205磷酸化增加使得TAU微管成核活性降低，微管解聚和不稳定，同时与后来转化为原丝和细丝有关[30]；Thr205的磷酸化可特异性抑制淀粉样蛋白β(Aβ)的毒性，是具有保护作用而不是毒性促进作用的唯一位点[31]；Ser199的磷酸化是AD中，脆弱的神经元向神经纤维变性失衡的关键步骤[23]。Yu等研究表明Thr181，Thr205，Thr217和Ser404磷酸化在大鼠胚胎期和出生后早期在神经突生长中起关键作用，Ser202，Thr212，Ser356和Ser404的磷酸可能与神经突生长无关[11]。所有这些位点的磷酸化也不是完全独立的，如必须先磷酸化Ser235才能使Thr231磷酸化[26]；Ser214处的磷酸化显着抑制了随后在Thr212和Thr217处的磷酸化，；Ser409处的磷酸化抑制了随后在Ser404处的磷酸化[32]。

2 正常成人TAU磷酸化位点

对人脑组织活检的研究表明，正常人脑TAU在大多数与PHF-TAU相同的位点上以低计量水平被磷酸，病理上这些位点则磷酸化过度[7，33]。由于检测方法的不同，所检测到的正常人脑TAU的磷酸化位点也不同。这些位点包括活检法检测到位点：Thr-181、Ser-202、Ser-214、Thr-231、Ser-262、Ser-396、Ser-404、Ser-409[26，34～36]；质谱法检测到的位点：Thr-50、Thr-52、Thr-56、Ser61/Thr63/er64(至少两个点)、Ser-68、Thr-69、Thr-71、Thr-76、Thr-101、Thr-102、Thr-111、Ser-113、Thr-123、Thr-175、Thr-181、Ser-184、Ser-185、Ser-198、Ser-199、Ser-202、Thr-212、Ser-214、Thr-217、Thr-231(不确定)、Ser-396、Ser-404、Ser-409、Ser-411、Ser-412、Ser-413(Ser411/Ser412/Ser413至少2个点)、Ser-416[37]；IIPSC法检测到的位点：Thr-181、Ser-198、Ser-199、Ser202/Thr205、Thr-231、Ser-262、Ser-396、Ser400/、Thr403/、Ser404Ser-416[1，38]。一定水平的磷酸化是正常的，有助于神经元维持其微管网络和细胞活性。Barthélemy R等用质谱法检测正常人CSF中TAU磷酸化位点，如表1所示，但是与AD患者相比，磷酸化水平较低。

表1 CSF中磷酸化位点

在人脑的天然TAU中，Ser422磷酸化程度非常弱或完全不被磷酸化[35]。也有其他研究方法显示正常成年人大脑中TAU的Ser195、Ser198、Ser199、Thr212位点不会被磷酸化，Ser199位点在儿童及青年期被磷酸化，但随着年龄的增长磷酸化水平降低[23]。

Thr172，Ser193，Thr222，Ser387和Ser395是大鼠脑TAU中磷酸化的正常位点[39]，正常大鼠TAU在Thr212，Thr217，Thr231，Ser396，Ser404，Ser422的磷酸化非常低，而在AD大鼠中的磷酸化增加到10到100倍[11]。

3 胎儿脑TAU磷酸化位点

与正常成人脑TAU相比，胎儿脑TAU磷酸化程度更高，但没有明显的毒性[28，34]。成年大脑整体TAU磷酸化水平的降低可能是由于磷酸酶水平的升高，以及激酶水平下调[11，23，39]。

TAU的表达和磷酸化水平均受发育调节。高磷酸化的TAU是发育过程中轴突发生所必需的，对微管可塑性具有必要性[36]。发育中大脑的TAU可能比成熟大脑的TAU具有更小的微管结合活性[11]。与成人脑TAU相比，胎儿脑TAU在与AD脑几个相同的磷酸化位点上被高度磷酸化，如表2所示，但Ser 409位点高度磷酸化似乎是AD特有的[36]。

Hefti等在大鼠中也有相似发现，但与人脑不全相同，如表2所示。AD大鼠大脑Ser214位点的磷酸化水平低于或与胎儿大鼠大脑相似，但人胎儿大脑中Ser214位点的磷酸化程度比AD患者要强得多[38]。Ser262和Ser356，位于微管结合域内，可以认为Ser262和Ser356位点的磷酸化对发育大脑中TAU的生物学活性至关重要[11]。

表2 人与大鼠胎儿Tau磷酸化位点

尽管正常发育中的大脑和AD大脑的TAU都在多个位点被高度磷酸化，且在前者中发现了无毒的TAU聚集体[36]，但只有后者抑制了微管的组装，并聚合成NFT[11]，正常胎儿大脑TAU的高度磷酸化不足以诱导神经原纤维病理。

4 FAD与SAD的TAU磷酸化位点

大多数AD病例是散发性的，病因不明，称为散发性阿尔茨海默氏病(SAD)，只有5%的AD患者表现出该病的家族性单基因形式，称为家族性阿尔茨海默氏病(FAD)[40]。在FAD病例中，约有一半与早老素1(PS-1)基因突变有关，而早老素2(PS-2)和淀粉样蛋白前体蛋白(APP)基因突变代表较少[41]。FAD早期发病，迅速发展到终末期期[42]。有证据显示PS-1突变加速NFT形成，这表明PS-1突变也可能影响TAU磷酸化[7]，但PS-1突变的多态性不影响与AD发生和发展有关的最终神经病理学，FAD和SAD之间的总病理负荷没有差异[42]。

在FAD和SAD患者诱导多能干细胞(iPSC)系衍生的神经元中比较TAU超磷酸化的研究显示，Ser262、Ser396、Ser202 / Thr205、Thr181、Ser198、Ser199、Thr231、Ser400 / Thr403 / Ser404、Ser416位点磷酸化水平在FAD和SAD衍生的神经元之间未观察到主要差异[1，38]。

与年龄匹配的野生型同窝仔(WTs)相比，表达PS-1(L235P)的老年(21月半龄)转基因小鼠海马中，TAU在Ser396，Ser404，Thr231和Ser198 / 199/202表位的磷酸化显着增加[43]。

5 尸检与活检

从活检到尸检，AD患者SP和NFT的密度以及小胶质细胞活化显着增加[42]。尸检的AD患者大脑TAU磷酸化水平降低，很大程度上归因于磷酸酶的能量非依赖性活性[43]，长期的尸检间隔时间(PMI)可能会低估TAU磷酸化水平[44]。活检来源患者大脑TAU不会因组织中的内源性磷酸酶而经历极快的去磷酸化作用[25]。但是相较于正常人，AD患者死后验尸延迟期间的磷酸化位点迅速脱磷酸化程度低，这可能是由于蛋白质磷酸酶活性不足以及TAU的聚集所致[7]。

6 总 结

AD是一种复杂的多因素疾病。AD典型的病理标志是NFT和细胞外的SP。多达30%的正常老年人大脑中的Aβ斑块负荷与AD的典型病例一样多，但是他们缺乏Aβ斑块周围的TAU病理性营养不良性神经突[45]。免疫疗法是在AD治疗领域最有希望的方法之一。但是，针对Aβ的免疫疗法临床试却验接连失败，主要原因之一是大脑中的Aβ负荷与痴呆程度无关。靶向TAU的免疫疗法是针对Aβ免疫疗法失败之后的新方向。AD病理毒性，主要是由于TAU过度磷酸化所致[46]，所以对TAU磷酸化位点的研究，将会为更有效的治疗提供靶点。同时，AD患者CSF与大脑中的TAU磷酸化位点不全相同，CSF中TAU磷酸化位点研究将为AD诊断的生物标志物提供有意义的依据。

不同的实验研究对象及方法会出现不同的实验结果。鼠和人脑TAU磷酸化位点不全相同；由于磷酸激酶与磷酸酶的变化，相对于活检，尸检TAU磷酸化位点减少；Western、Elisa、免疫组化、Dot-Blot等实验方法的不同，也会使得实验结果有偏差。现在，质谱法、ipsc等方法为研究TAU磷酸化位点提供新的思路，TAU磷酸化位点的研究前景也将会越来越明朗。