活血荣络方调控生物钟蛋白Bmal1改善bEnd.3细胞糖氧剥夺/复氧损伤后血管新生的机制研究

张宇星，张 瑛，曾富康，郭 纯，高晓峰，李 中，陈 瑶，周德生*，刘利娟*

活血荣络方调控生物钟蛋白Bmal1改善bEnd.3细胞糖氧剥夺/复氧损伤后血管新生的机制研究

张宇星1，张 瑛1，曾富康1，郭 纯2，高晓峰2，李 中2，陈 瑶2，周德生2*，刘利娟2*

1. 湖南中医药大学，湖南 长沙 410000 2. 湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410000

基于阴阳理论及活血荣络方（Huoxue Rongluo Recipe，HXRL）对脑梗死后血管新生的影响，探讨HXRL调控生物钟蛋白脑和肌肉芳烃受体核转位蛋白1（brain and muscle Arnt-like 1，Bmal1）促内皮细胞血管新生的作用机制。采用Western blotting检测小鼠脑微血管内皮细胞株（bEnd.3）受到糖氧剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）损伤后各时间点生物钟蛋白Bmal1和Clock的表达；利用染色质免疫共沉淀-测序分析（chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq）明确Bmal1在全基因组中发挥的作用，以及对bEnd.3细胞生物进程、细胞组成及分子功能的影响。采用CCK-8法检测HXRL含药血清最佳干预浓度，敲降bEnd.3细胞基因，设置对照组、模型组、HXRL含药血清组、si-Bmal1组和si-Bmal1＋HXRL含药血清组，通过划痕、迁移、成管等实验检测细胞迁移及血管形成能力；采用免疫荧光检测各组血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和神经源性基因Notch同源蛋白1（neurogenic locus notch homolog protein 1，Notch1）表达；采用Western blotting检测VEGF、基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinases 2，MMP2）、Notch1蛋白胞内结构域（notch1 intracellular domain，NICD）和δ样蛋白4（delta-like protein 4，DLL4）蛋白表达。bEnd.3细胞受到OGD/R损伤后，Bmal1及Clock蛋白表达逐渐升高，造模8、12、16、20 h后具有显著差异（＜0.05、0.001）。ChIP-seq提示Bmal1在内皮细胞中参与细胞发育、分化、增殖等进程，靶向调节VEGF、Notch1启动子区域。CCK-8实验结果显示，bEnd.3细胞受到OGD/R损伤后，10%的HXRL含药血清可有效改善细胞活力（＜0.001）。划痕、迁移及成管实验证实HXRL含药血清可有效改善bEnd.3细胞OGD/R损伤后的迁移能力及血管生成能力（＜0.05、0.01、0.001），但在敲降株中，该促进作用被抑制（＜0.05、0.01、0.001）。免疫荧光及Western blotting结果显示，HXRL含药血清可进一步升高OGD/R损伤的bEnd.3细胞中VEGF、MMP2、NICD、DLL4、Bmal1及Clock蛋白表达（＜0.05、0.01、0.001），在敲降株中，HXRL含药血清对VEGF、MMP2、NICD及DLL4的促表达作用被抑制（＜0.05、0.01、0.001）。HXRL可有效促进内皮细胞经OGD/R损伤后的血管生成能力，其作用机制与调控生物钟Bmal1蛋白密切相关。

活血荣络方；脑梗死；生物钟蛋白Bmal1；氧糖剥夺；Bmal1敲降株；血管新生

缺血性脑卒中（ischemic cerebral stroke，ICS）是严重危害我国国民健康的重大慢性非传染性疾病，具有高发病率、高致残率、高死亡率、高复发率、高经济负担5大特点[1-2]。研究表明，脑梗死周围区域的缺血区微血管密度（microvessel density，MVD）增加可提高ICS患者的生存时间[3]。尽快建立三级侧支循环——新生血管可恢复局部血流供应，挽救缺血半暗带内濒临死亡的神经细胞，为神经-血管结构的可塑性创造良好的微环境，恢复缺损的神经功能，改善患者预后，是当前治疗的有效策略之一[4-6]。生物节律是生物体在进化过程中，为适应光照、温度等自然节律变化而形成的以24 h为周期的节律活动[7]。众多生物钟基因[、脑和肌肉芳烃受体核转位蛋白1（brain and muscle Arnt-like 1，）、、]的转录/翻译反馈回路（transcriptional/translational feedback loops，TTFLs）产生细胞自主节律，影响着机体的炎症免疫、代谢等生理病理过程[8-9]。生物节律显著影响脑卒中的易感性、损伤、恢复和对治疗的反应机制[10]，生物节律紊乱可加重脑梗死后神经功能缺损症状，增加脑梗死面积[11]。过表达生物钟基因可促进脑梗死后血管新生，研究表明，机体受到缺血缺氧损伤后，可通过上调内皮细胞（endothelial cells，ECs）的血管内皮生成因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管生成素（angiopoietin，ANG）的表达，促进血管新生[12-13]。

活血荣络方是本课题组根据治疗脑梗死多年的临床经验，在“荣气虚滞理论”的指导下，依据阴虚血瘀病机，制定的具有调和阴阳、养阴生津、活血养血、舒筋活络通脉功效的科室协议方，其组成以鸡血藤、石楠藤为君，生地黄、玄参、黄精为臣，乳香、没药为佐、川芎为使[14]。本课题组前期研究发现，活血荣络方可明显增加脑梗死大鼠海马区CD34阳性细胞及皮质区VEGF表达，增加缺血区MVD，促血管新生[15]。本研究旨在探讨生物钟蛋白Baml1对内皮细胞血管新生的影响以及活血荣络方的干预机制。

1 材料

1.1 动物与细胞株

SPF级SD雄性大鼠20只，12～15周龄，体质量250～280 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（湘）2016-0002，于湖南中医药大学第一附属医院实验动物中心饲养，实验许可证号SYXK（湘）2015-0003，依照实验动物中心管理办法，温度21～26 ℃，湿度40%～50%，通风良好，昼夜交替，分笼标准饲料、自由饮水，适应性饲养7 d后用于实验。本研究经湖南中医药大学第一附属医院伦理委员会批准（伦理批准号ZYFY20211016）。

1.2 细胞株

小鼠脑微血管内皮细胞株（bEnd.3，批号CL-0598）购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.3 药材

鸡血藤、石楠藤、生地黄、玄参、黄精、乳香、没药、川芎均购自湖南中医药大学第一附属医院中药房，经湖南中医药大学第一附属医院张裕民主任药师鉴定分别为豆科植物密花豆Dunn的干燥藤茎、胡椒科植物石楠藤(Miq.) Hand.-Mazz.的干燥带叶茎枝、玄参科植物地黄Libosch.的干燥块根、玄参科植物玄参Hemsl.的干燥根、百合科植物黄精Red.的干燥根茎、橄榄科乳香树属植物乳香树Birdw.树皮渗出的树脂、橄榄科植物地丁树Engl.的干燥树脂、伞形科植物川芎Hort.的干燥根茎，均符合《中国药典》2020年版规定。

1.4 药品与试剂

嘌呤霉素（批号P8230）购自北京索莱宝生物科技有限公司；胎牛血清（批号164210-50）、青霉素-链霉素混合液（批号PB180120）、0.25%胰蛋白酶-EDTA（批号PB180229）、DMEM高糖培养基（批号PM150210）、DMEM无糖培养基（批号PM150270）、PBS缓冲液（批号PB180327）、无血清非程序冻存液（批号PB180438）均购自武汉Procell公司；CCK-8试剂盒（批号CK04）购自日本同仁公司；Matrigel基质胶（批号356234）购自美国BD公司；Transwell 24孔板（批号3422）购自美国Corning公司；β-actin抗体（批号20536-1-AP）、基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）抗体（批号10373-2-AP）、神经源性基因Notch同源蛋白1（neurogenic locus notch homolog protein 1，Notch1）抗体（批号10062-2-AP）、HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（批号SA00001-2）购自武汉Proteintech公司；VEGF抗体（批号ab52917）、Bmal1抗体（批号ab3350）、驴抗兔IgG H&L抗体（批号ab150075）购自英国Abcam公司；Clock抗体（批号sc-271603）购自美国Santa公司；δ样蛋白4（delta-like protein 4，DLL4）抗体（批号A12943）购自武汉Abclonal公司；Dylight 549标记的山羊抗兔IgG抗体（批号A23320）购自美国Abbkine公司；siRNA慢病毒载体由上海汉恒基因科技有限公司提供。

1.5 仪器

3427型普通培养箱、3131型三气培养箱、900Series型超低温冰箱、Fresco17型低温高速离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；TD5A型低速离心机（长沙英泰仪器有限公司）；SYG-1210型恒温水浴锅（美国Crystal仪器公司）；Axio Vert.A1型倒置显微镜（德国ZEISS公司）；Cytation3型多功能酶标仪（美国BioTek公司）；SW-CJ-1F型超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）。

2 方法

2.1 活血荣络方的制备

取鸡血藤30 g、石楠藤30 g、生地黄15 g、玄参10 g、黄精15 g、乳香10 g、没药10 g、川芎10 g，加入10倍量水浸泡12 h后，煎煮2 h，滤过；加入8倍量水煎煮1 h，滤过；加入5倍量水，煎煮1 h，滤过，合并3次提取液，通过旋转蒸发仪将其浓缩为浸膏，于4 ℃保存备用。经高效液相色谱检测其主要有效成分芒柄花素、薯蓣皂苷、正丁烯基苯酚、黄芩苷的质量分数分别为4.298、3.568、1.779、18.634 mg/g。

2.2 活血荣络方含药血清的制备

雄性SD大鼠20只按照随机数字表法随机分为对照组和给药组（生药23.4 g/kg）。给药组ig相应药物，对照组ig等体积蒸馏水，1次/d，连续7 d。于末次给药1 h后，大鼠ip 10%水合氯醛（3 mg/kg）深度麻醉，暴露腹主动脉，使用负压采血管采集全血5 mL至无抗凝剂的普通采血管中，静置1 h，3000 r/min离心10 min，收集上清于离心管中，于56 ℃水浴灭活30 min，经0.22 μm滤膜滤过除菌，即为活血荣络方含药血清和对照血清，于−80 ℃保存备用。

2.3 bEnd.3细胞培养

bEnd.3细胞用含5% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM高糖培养基，于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，待融合度达到80%～90%时进行传代。

2.4 活血荣络方含药血清对糖氧剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）诱导bEnd.3细胞损伤模型细胞存活率的影响

取对数生长期的bEnd.3细胞，以1×104个/孔接种于96孔板中，另设调零孔（不接种细胞）。设置对照组、模型组和给药组，对照组于正常条件下培养；模型组将培养基更换为DMEM无糖培养基，并将细胞置于37 ℃、5% CO2、95% N2、1% O2的三气培养箱中培养6 h，随后移出三气培养箱，更换为完全培养基于普通培养箱中培养24 h；给药组将培养基更换为DMEM无糖培养基，缺氧培养6 h，随后移出三气培养箱，分别加入5%、10%、15%、20%的活血荣络方含药血清，于普通培养箱中培养24 h。更换新鲜培养基，每孔加入10 μL CCK-8溶液，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养2 h，采用酶标仪测定450 nm处的吸光度（）值，计算细胞存活率。

细胞存活率＝(实验－调零)/(对照－调零)

2.5 染色质免疫共沉淀-测序分析（chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq）获取转录因子Bmal1的DNA结合片段

以37%的甲醛溶液交联固定培养瓶内bEnd.3细胞，培养瓶中加入甘氨酸室温终止反应，用细胞刮刀刮取细胞，离心，使用细胞裂解液和ChIP缓冲液混合物充分裂解细胞；冰上超声处理DNA片段，10 000 r/min离心5 min，取上清进行琼脂糖凝胶电泳，检测DNA长度（200 bp左右）；各取100 μL超声产物置于2 mL EP管中并标记为IgG组、IP组和Input组，其余上清分装后于−80 ℃保存。在各EP管中加入900 μL ChIP缓冲液，IP组加入5 μL Bmal1抗体，IgG组加入5 μL IgG血清，充分混匀后4 ℃孵育过夜；加入40 μL经过洗涤、鱼精DNA封闭、TE洗涤的Protein G凝胶，于4 ℃混合器中孵育1～2 h，3000 r/min离心2 min沉淀凝胶，取上清暂存，留沉淀，依次用低盐洗脱缓冲液、高盐洗脱缓冲液和TE缓冲液冲洗，3000 r/min离心2 min后沉淀凝胶，吸取上清；每管加200 μL ChIP洗脱缓冲液，温和涡旋，65 ℃孵育30 min，间隔5 min拿出温和振荡；每管加入NaCl解交联；DNA产物纯化回收，将回收的DNA进行高通量测序。

2.6 bEnd.3细胞慢病毒转染及鉴定

bEnd.3细胞以5×104个/孔接种于6孔板中，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。根据感染复数（MOI）＝30计算，使用10 μLsiRNA慢病毒载体转染bEnd.3细胞，转染24 h后，更换新鲜的DMEM培养基。72 h后加入含5 μg/mL嘌呤霉素的DMEM高糖培养基，继续培养3 d后，通过荧光显微镜观察细胞的转染情况达到95%以上，最终得到si-Bmal1慢病毒转染的bEnd.3细胞稳定株。

2.7 分组及给药

设置对照组、模型组、活血荣络方组、si-Bmal1组和si-Bmal1＋活血荣络方组。对照组于正常条件下培养；模型组按“2.4”项下方法处理；活血荣络方组将培养基更换为DMEM无糖培养基，缺氧培养6 h后，加入10%活血荣络方含药血清，于普通培养箱中培养24 h；si-Bmal1组在模型组基础上进行si-Bmal1慢病毒转染；si-Bmal1＋活血荣络方组在si-Bmal1组基础上加入10%活血荣络方含药血清干预24 h。

2.8 划痕实验检测bEnd.3细胞迁移能力

用标记笔在6孔板背后划5条间距均匀的横线，以作参考。每孔加入2×105个细胞，细胞密度达到85%，用无血清培养基培养24 h进行周期同步化，用移液枪头尖端划过单层细胞，用PBS清洗脱落的细胞。按“2.7”项下方法进行分组及给药，于显微镜下观察并拍照，记录0、24 h划痕面积，计算划痕愈合率。

划痕愈合率＝(0 h划痕面积－24 h划痕面积)/0 h划痕面积

2.9 Transwell小室实验检测bEnd.3细胞迁移能力

将bEnd.3细胞以2×104个/孔接种到Transwell上腔室，按“2.7”项下方法进行分组及给药，对照组、模型组和si-Bmal1组上、下室均添加含药血清的DMEM无糖培养基，给药组添加10%活血荣络方含药血清的DMEM无糖培养基。缺氧处理6 h后，将下室的培养基替换为600 μL含20% FBS的DMEM高糖培养基及质量浓度为20 μg/L的VEGF，于37 ℃、5% CO2的培养箱中孵育24 h后，去除残留在上室膜表面的细胞。下室膜表面的bEnd.3细胞用4%甲醛固定，0.1%结晶紫染色。染色细胞拍照并在5个随机镜下计数，用Image J软件进行定量。

2.10 Matrigel基质胶实验检测bEnd.3细胞管腔形成能力

将基质胶于4 ℃冰箱过夜融化，96孔板和200 µL枪头在4 ℃冰箱预冷备用。于冰上以基质胶（50 µL/孔）包被96孔板，置于培养箱凝固60 min。取处于对数生长期的bEnd.3细胞，用含10%对照血清和活血荣络方含药血清的DMEM高糖培养基分别重悬细胞，以2×104个/孔接种至提前用基质胶包被的96孔板，缺氧培养6 h，于显微镜下观察，拍照成管细胞，并随机选取3个视野，用Image Pro Plus 6.0分析系统计数每孔4个随机选定视野下分支点。

2.11 Western blotting检测细胞中Bmal1、Clock、VEGF、MMP-2、Notch-1及DLL4蛋白表达

bEnd.3细胞接种于10 cm培养皿中，细胞融合度达到90%时，用无血清培养基培养24 h，缺氧处理6 h后，分别于4、8、12、16、20、24 h收集细胞，用以检测生物钟蛋白变化。药物组则分别加入10%对照血清和活血荣络方含药血清作用24 h后收集细胞，用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞，提取总蛋白。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入5%脱脂牛奶，室温摇床封闭2 h，分别加入Bmal1抗体（1∶2000）、Clock抗体（1∶400）、VEGF抗体（1∶2000）、MMP2抗体（1∶1000）、Notch1抗体（1∶1500）、DLL4抗体（1∶1500）和β-actin抗体（1∶8000），4 ℃孵育过夜；洗膜，加入HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（1∶8000），室温摇床孵育2 h；洗膜后加入ECL超敏发光液，采用凝胶成像仪进行成像，运用Image J软件分析条带灰度值。

2.12 免疫荧光检测细胞中VEGF和Notch-1蛋白表达

取处于对数生长期的bEnd.3细胞，以5×103/孔接种于预先放置好爬片的24孔板中，当融合度达到20%～30%时，缺氧处理6 h，再给予10%活血荣络方含药血清正常处理24 h。弃去培养液，各孔加入500 μL 4%多聚甲醛固定15 min；PBS缓冲液润洗细胞后，加入500 μL 0.25% TritonX-100破膜3 min；PBS缓冲液润洗后，加入5%牛血清白蛋白，室温封闭30 min；分别添加100 μL VEGF和Notch1抗体（1∶100），4 ℃过夜；PBS润洗后，分别滴加100 μL驴抗兔IgG H&L抗体和Dylight 549标记的山羊抗兔IgG抗体和（1∶500），室温避光孵育60 min；PBS缓冲液润洗细胞，滴加DAPI，室温避光孵育3～5 min；PBS缓冲液润洗后，取载玻片，滴加10 μL抗荧光衰减封片剂，于荧光显微镜下观察并拍照。

2.13 统计学方法

3 结果

3.1 OGD/R增加bEnd.3生物钟蛋白Bmal1及Clock表达

首先对bEnd.3细胞进行周期同步化，糖氧剥夺6 h后复糖复氧，并在随后的20 h内，每4小时提取蛋白，检测生物钟蛋白Bmal1与Clock表达变化。如图1所示，复糖复氧4 h，生物钟蛋白Bmal1与Clock表达无明显变化，复糖复氧8 h二者表达量与对照组比较均明显升高（＜0.05），复糖复氧12～20 h，Bmal1与Clock蛋白表达均显著升高（＜0.001）。表明OGD/R损伤可使内皮细胞生物钟发生改变，且呈不断升高的趋势，根据本研究结果，将糖氧剥夺6 h/复糖复氧12 h作为后续实验方案。

3.2 Bmal1蛋白在内皮细胞中的生物学功能分析

生物钟蛋白可调控分子功能，参与细胞增殖、迁移、分化等生物进程。Bmal1可促进血管新生，减轻缺氧缺氧损伤，但其在内皮细胞中的转录调控尚未报道，故借助ChIP-seq技术探究Bmal1在内皮细胞中的全基因组转录调控作用。使用特异性抗体Bmal1（IP级别）与DNA片段进行交联形成复合物后发生免疫沉淀（图2）。

A-对照组 B-4 h组 C-8 h组 D-12 h组 E-16 h组 F-20 h组 与对照组比较：*P＜0.05 ***P＜0.001

解交联后纯化的DNA片段进行高通量测序，得到与蛋白质相结合的DNA序列信息，通过对该序列的长度和比对到该序列上的Pair and Read数来确定该序列对应的峰的相对丰度。图3显示Peak在基因组的不同功能区分布情况，结合启动子-转录起始区（promotor-transcriptional start site region，promotor-TSS）达7.77%，图4显示在TSS上下游2000个bp所捕获reads数。基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析获得生物进程（biological process，BP）、细胞组成（cellular component，CC）及分子功能（molecular function，MF）相关基因的分布（图5），靶点涉及的BP条目主要富集在细胞发育、神经再生分化、细胞形态、调节细胞增殖等，靶点涉及的MF相关的条目主要富集在离子结合、小分子结合、转移酶激活等，靶点涉及CC相关主要富集在胞质、质膜、细胞骨架、神经元细胞等。

图2 Western blotting检测bEnd.3细胞免疫共沉淀

图3 Peak在基因组功能区的分布

图4 Reads在转录起始位点(TSS区) 两侧的分布(n = 3)

图5 Bmal1在内皮细胞潜在靶点GO功能富集分析

关联分析（图6）发现，Bmal1蛋白可以靶向结合小鼠脑微血管内皮细胞中血管新生关键基因，如17号染色体上基因的启动子序列（位点46030452～46030695），2号染色体上基因的增强子序列（位点26463954～26464324），16号染色体上基因的启动子序列（位点30066868～30067165、30065082～30065373、30064015～30064496）。

3.3 活血荣络方含药血清对OGD/R诱导bEnd.3细胞损伤模型细胞存活率的影响

为探索活血荣络方对内皮细胞的保护作用及与生物节律联系的作用机制，首先通过CCK-8检测活血荣络方含药血清对OGD/R损伤内皮细胞的保护作用。如图7所示，与对照组比较，模型组细胞存活率显著降低（＜0.001）；与模型组比较，10%、15%活血荣络方含药血清组细胞存活率均显著升高（＜0.01、0.001），且10%活血荣络方含药血清作用最佳。表明活血荣络方含药血清能减轻OGD/R诱导的bEnd.3细胞损伤，具有内皮细胞保护作用，故以10%含药血清作为后续实验浓度。

图6 Reads在关联基因VEGF、Notch1和HES1的分布情况(n = 3)

3.4 活血荣络方含药血清对OGD/R诱导bEnd.3细胞损伤模型迁移能力的影响

本课题组前期实验表明，活血荣络方可有效促进脑梗死大鼠血管新生，为探索活血荣络方对内皮细胞的保护作用及与生物节律联系的作用机制，利用RNA干扰技术，构建生物钟基因敲降bEnd.3细胞稳转株，用于体外验证。于荧光显微镜下观察慢病毒绿色荧光蛋白表达率，转染效率达97%以上时，提取RNA及蛋白验证的mRNA与蛋白敲降效率，如图8所示，在3组siRNA中，siRNA2的敲降效率最佳，的mRNA及蛋白表达均下降50%左右，故将siRNA2稳转株作为后续实验细胞。

A-对照组 B-模型组 C-5% HXRL组 D-10% HXRL组 E-15% HXRL组 F-20% HXRL组 与对照组比较：***P＜0.001；与模型组比较：##P＜0.01 ###P＜0.001

A-对照组 B-siRNA1沉默组 C-siRNA2沉默组 D-siRNA3沉默组 与对照组比较：**P＜0.01 ***P＜0.001

利用划痕、Transwell研究内皮细胞血管生成表型，如图9所示，与对照组比较，模型组细胞迁移率显著升高（＜0.01、0.001），表明OGD/R损伤促进bEnd.3细胞迁移；与模型组比较，si-Bmal1组细胞迁移率显著降低（＜0.05、0.01），提示敲降后，细胞迁移能力受限；活血荣络方可进一步提升bEnd.3细胞OGD/R损伤后的迁移能力（＜0.01、0.001），敲降细胞株中，活血荣络方的促迁移能力受到限制（＜0.01、0.001）。

3.5 活血荣络方含药血清对OGD/R诱导bEnd.3细胞损伤模型成管能力的影响

管腔形成是评价内皮细胞血管新生能力的另一重要指标，利用成管实验评价Bmal1与HXRL对bEnd.3细胞OGD/R损伤模型的影响。如图10所示，与对照组比较，模型组血管分支总长度显著增加（＜0.01），提示OGD/R损伤显著促进bEnd.3细胞成管能力；与模型组比较，si-Bmal1组血管分支总长度明显下降（＜0.01），表明敲降可降低bEnd.3细胞的管腔形成能力；活血荣络方组血管分支总长度增加（＜0.05），敲降后，血管分支总长度则明显下降（＜0.05），表明活血荣络方具有促bEnd.3细胞OGD/R损伤后的管腔形成能力，而在敲降株中该促进作用被抑制。

3.6 活血荣络方含药血清对OGD/R诱导bEnd.3细胞损伤模型中生物钟及血管新生关键蛋白表达的影响

VEGF及Notch1是内皮细胞参与血管新生的重要分子，Bmal1可调控上述关键分子的转录过程，采取免疫荧光法检测各组细胞中VEGF及Notch1蛋白表达。如图11所示，与对照组比较，模型组VEGF及Notch1蛋白表达水平显著升高（＜0.001）；与模型组比较，si-Bmal1组VRGF及Notch1蛋白表达水平显著下降（＜0.01、0.001）；活血荣络方含药血清可进一步上调VEGF及Notch1蛋白表达水平（＜0.001），敲降后，VEGF及Notch1蛋白表达水平显著下降（＜0.01、0.001）。

A-对照组 B-模型组 C-HXRL组 D-si-Bmal1组 E-si-Bmal1+HXRL组 与对照组比较：△P＜0.05 △△P＜0.01 △△△P＜0.001；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；与HXRL组比较：&P＜0.05 &&P＜0.01 &&&P＜0.001；与si-Bmal1组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001，下图同

图10 Bmal1及活血荣络方对bEnd.3细胞成管能力的影响(, n = 3)

Western blotting检测结果见图12、13，与对照组比较，模型组Clock、Bmal1、NICD、DLL4、MMP2和VEGF蛋白表达水平均显著升高（＜0.05、0.01、0.001）；给予活血荣络方含药血清干预后，Clock、Bmal1、NICD、DLL4、MMP2和VEGF蛋白表达水平进一步升高（＜0.05、0.01、0.001），敲降后，NICD、DLL4、MMP2和VEGF蛋白表达水平均显著降低（＜0.05、0.01、0.001）。

图11 Bmal1及活血荣络方对bEnd.3细胞内VEGF和Notch1蛋白表达的影响(, n = 3)

图12 活血荣络方对bEnd.3细胞Clock和Bmal1蛋白表达的影响(, n = 3)

图13 Bmal1及活血荣络方对bEnd.3细胞NICD、DLL4、MMP2及VEGF蛋白表达的影响(, n = 3)

4 讨论

脑梗死的损害主要来源于血液灌注不足引起的持续缺氧损伤，侧支循环作为重要的保护补偿机制，可通过增加血液灌注，恢复氧供，改善ICS的预后[16]。血管新生属于三级侧支循环，由现有的血管中分离形式微血管网络，向发生在边界区的受影响区域提供氧气和营养物质，是应对脑梗死的关键保护机制[17-18]。研究表明，在脑梗死患者和动物模型中，血管生成可通过促进组织修复、血管重塑、改善缺血周围组织灌流，从而促进神经功能恢复[19-21]。因此，促进缺血后血管生成是临床治疗脑梗死的关键目标之一[5,21-23]。

哺乳动物的昼夜节律系统由中枢下丘脑视交叉上核和外周器官（包括血管、心脏等器官）中的昼夜节律振荡器组成。这些振荡器通过多个生物钟基因（包括、、、家族基因）的转录/翻译反馈回路产生细胞自主节律。这种多振荡器系统在所有生理系统（包括心血管、代谢、免疫和炎症功能）中产生内源性昼夜节律，该网络的破坏会导致内部不同步和昼夜节律紊乱，促进疾病发生发展[24-25]。研究发现，昼夜节律紊乱可升高ICS发病率，与高密度脂蛋白胆固醇水平降低、三酰甘油水平升高、皮质醇节律紊乱、C反应蛋白升高、血压升高、胰岛素敏感性降低和葡萄糖水平升高的糖尿病前期状态密切相关[10,26-29]。此外，昼夜节律紊乱可增加ICS梗死面积，加重免疫炎症反应，损伤内皮功能[11,30]。昼夜节律不仅是ICS的独立危险因素，在ICS后的血管新生进程中，同样发挥着不可替代的作用。研究表明，生物钟蛋白调控促血管生成因子的分泌、基底膜（basement membrane，BM）降解、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）重塑及内皮细胞增殖迁移。−∕−小鼠中MMPs家族蛋白表达升高，进而促进BM降解与ECM重塑[31]。过表达可通过调控VEGF启动子活性，上调VEGF蛋白表达，促进缺血缺氧损伤的内皮细胞的血管生成能力，敲降表达可逆转Bmal1的促血管新生作用[13]。综上，昼夜节律影响着脑梗死发生、发展及预后，其关键分子在脑梗死后的血管新生发挥不可替代的作用。

昼夜节律与祖国医学中的阴阳平衡理论高度契合。自然界的昼夜变化之间，阴阳在不断地进行节律性的交替转化，人体的生理活动随着昼夜变化发生相应变化，影响着人体内的阴阳平衡[32]。《杂病广要》记载：“夫中风者，皆因阴阳不调，脏腑气偏，荣卫失度”，指出阴阳失衡是脑梗死发生的根本，恢复脏腑功能、调节荣卫之司为诊治脑卒中的关键。其中精、血、津液属阴，气属阳，“阴在内，阳之守也；阳在外，阴之使也”，即达到人体阴阳动态平衡，故阴阳平衡理论对诊治脑梗死具有较高的临床指导意义。本课题组根据多年的临床实践与理论探索，在脑藏象理论的指导下，提出荣气为精、气、血、津液等精微物质的总称，各种成分相互依存、平衡转化，是维持生命健康的重要条件[14]。当脑梗死疾病发生后，阴阳失调，荣气虚滞，精微物质匮乏致滋养不足，荣气之荣养、化变、成形功能障碍，新生血管受限[33]。基于阴阳理论及荣气理论，创制具有调和阴阳、养阴生津、活血养血等功效的活血荣络方，该方为湖南中医药大学第一附属医院院内制剂，纳入临床路径达13年。本课题组前期研究发现，活血荣络方可上调VEGF、Kruppel样因子4（kruppel-like factor 4，KLF4）、微囊蛋白-1（caveolin-1，CAV-1）表达，下调MMP9表达，激活Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信号传导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路，减轻脑梗死急性期炎性反应，增加MVD，促进血管新生，改善脑梗死后神经功能缺损症状[15]。

本研究结果表明，活血荣络方具有促进OGD/R损伤的bEnd.3细胞的血管新生能力，且该促进作用依赖于对生物钟蛋白Bmal1的调控。首先，bEnd.3细胞受到OGD/R损伤后，生物钟蛋白Bmal1及Clock的表达随时间延长而升高，表达量于12～20 h显著升高，提示二者可能在OGD/R损伤的内皮细胞中发挥保护作用，故利用ChIP-seq探究Bmal1在内皮细胞中全基因组的调控功能，发现Bmal1参与细胞发育、神经再生分化、细胞形态、细胞增殖等生物进程，并与血管新生关键分子VEGF、Notch1等启动子区靶向结合，可作为转录激活因子，直接调节生长因子的表达，表明Bmal1可能在OGD/R损伤后的血管新生进程中扮演着不可或缺的角色。既往研究表明，−∕−小鼠的后肢在缺血缺氧损伤后，其血管生成能力显著下降，VEGF表达降低，过表达则可明显促进人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的迁移和成管能力[13]。为此，进一步构建bEnd.3细胞敲降株，以探究Bmal1及活血荣络方含药血清对OGD/R损伤的bEnd.3细胞血管生成能力的影响。结果显示，敲降的bEnd.3细胞在受到OGD/R损伤后，迁移能力及成管能力下降。同时，活血荣络方表现出了有效的促内皮细胞迁移及成管的能力，但此促进作用在敲降株中被逆转，提示活血荣络方的促血管新生作用可能依赖于对Bmal1的调控。

Western blotting结果显示，OGD/R损伤可显著升高bEnd.3细胞中生物钟蛋白Bmal1及Clock表达，活血荣络方进一步升高二者蛋白表达，提示具有调和阴阳的活血荣络方在调节OGD/R损伤后生物节律的过程中，发挥有效且显著的效果。免疫荧光及Western blotting结果表明，活血荣络方同样可进一步升高血管新生关键分子NICD、DLL4、MMP2及VEGF的蛋白表达，发挥促进血管新生的作用，但该促进效果在基因敲降的bEnd.3细胞株中收到抑制，可见活血荣络方的促血管新生作用依赖于对生物节律的调控。

生物节律调节哺乳动物生理和病理的大部分过程。大量的研究表明生物节律和血管生成相互作用，共同影响脑梗死后缺血缺氧损伤的恢复。综上，当内皮细胞受到缺血缺氧损伤后阴阳失衡，荣气中精微物质的消长转化受限，而活血荣络方能够有效通过调和阴阳，改善其生物节律，促进内皮细胞荣气之荣养、化变、成形功能。本研究为进一步中医药防治缺血性脑卒中提供了实验基础，丰富现代科学内涵。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Mechanism of Huoxue Rongluo Recipe on regulating circadian clock protein Bmal1 to improve angiogenesis in bEnd.3 cells after oxygen-glucose deprivation/ reperfusion injury

ZHANG Yu-xing1, ZHANG Ying1, ZENG Fu-kang1, GUOChun2, GAO Xiao-feng2, LI Zhong2, CHEN Yao2, ZHOU De-sheng2,LIU Li-juan2

1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410000, China 2. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410000, China

To explore the mechanism of Huoxue Rongluo Recipe (活血荣络方, HXRL) on promoting endothelial cells angiogenesis via regulating circadian protein brain and muscle arnt-like 1 (Bmal1) based on the theory of yin-yang and the effect of HXRL on angiogenesis after cerebral infarction.Western blotting was used to detect the expressions of circadian proteins Bmal1 and Clock at each time point after bEnd.3 cells were injured by oxygen-glucose deprivation/reperfusion (OGD/R). Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) was used to determine the role of Bmal1 in genome wide, and its effects on bEnd.3 cell biological process, cell component and molecular function. The optimal intervention concentration of HXRL containing serum was detected by CCK-8 method.gene was knocked down in bEnd.3 cells and divided into control group, model group, HXRL containing serum group, si-Bmal1 and si-Bmal1 + HXRL containing serum group. The expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF) and neurogenic locus notch homolog protein 1 (Notch1) were detected by immunofluorescence. Western blotting was used to detect VEGF, matrix metalloproteinases 2 (MMP2), Notch1 intracellular domain (NICD) and delta-like protein 4 (DLL4) protein expressions.After bEnd.3 cells were injured by OGD/R, the expressions of Bmal1 and Clock proteins were gradually increased, and there were significant differences at 8, 12, 16 and 20 h points after modeling (< 0.05, 0.001). ChIP-seq suggests that Bmal1 was involved in cell development, differentiation, proliferation, and other processes in endothelial cells, and targeted the transcriptional start site region of VEGF and Notch1. The results of CCK-8 experiment showed that after bEnd.3 cells were injured by OGD/R, 10% HXRL-containing serum could effectively improve cell viability (< 0.001). Scratch, migration and tube formation experiments confirmed that HXRL-containing serum could effectively improve the migration ability and angiogenesis ability of bEnd.3 cells after OGD/R injury (< 0.05, 0.01, 0.001), but inknockdown strains, this promotion was suppressed (< 0.05, 0.01, 0.001). The results of immunofluorescence and Western blotting showed that HXRL-containing serum could further increase the protein expressions of VEGF, MMP2, NICD, DLL4, Bmal1 and Clock in bEnd.3 cells damaged by OGD/R (< 0.05, 0.01, 0.001). Inknockdown strain, the promoting effect of HXRL-containing serum on the expressions of VEGF, MMP2, NICD and DLL4 was inhibited (< 0.05, 0.01, 0.001).HXRL can effectively promote the angiogenesis of endothelial cells after OGD/R injury, and its mechanism is closely related to the regulation of circadian clock Bmal1 protein.

Huoxue Rongluo Recipe;ischemic stroke; circadian clock protein Bmal1; oxygen-glucose deprivation; Bmal1 knockdown strain; angiogenesis

R285.5

A

0253 - 2670(2022)20 - 6509 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.20.023

2022-06-16

国家自然科学基金资助项目（82104766）；湖南省自然科学基金资助项目（2021JJ30521，2021JJ40424）；湖南省卫健委科研项目（202103071190）；湖南省中医药管理局资助项目（2021218）；湖南中医药大学中西医结合一流学科开放基金资助项目（2020ZXYJH38，2020ZXYJH39）；湖南中医药大学校级科研基金与联合基金项目（2021XJJJ039，2021XJJJ052）

张宇星，男，博士，从事中医药对脑血管病及其并发症的防治研究。Tel: 15616213284 E-mail: yuxing-zhang@foxmail.com

周德生，男，博士，主任医师，从事中医药对脑血管病及其并发症的防治研究。Tel: (0731)85369768 E-mail: 2478020529@qq.com

刘利娟，女，博士，副主任医师，从事中医药对脑血管病及其并发症的防治研究。Tel: (0731)85369768 E-mail: 601264967@qq.com

[责任编辑 李亚楠]