秦川牛PDHB基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

张 愈， 王晓宇， 周 兴， 邱 菊， 昝林森,3， 李安宁,3*

(1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2.四川省龙日种畜场，四川 红原 624400；3.国家肉牛改良中心，陕西 杨凌 712100)

丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase，PDH)由4个基因编码组成，分别为PDHA、PDHB、PDHC和PDHD，是参与糖代谢和脂肪酸代谢过程的关键酶[1-2]。其中丙酮酸脱氢酶β亚基(pyruvate dehydrogenase β subunit，PDHB)可催化丙酮酸转化为乙酰辅酶A(acetyl-CoA)，是将糖酵解和三羧酸循环代谢途径连接起来的关键酶[3]。PDHB基因突变或缺陷会导致一系列代谢疾病的发生[4-6]。在帕金森疾病相关研究中发现，PDHB基因表达水平的改变导致血浆中丙酮酸的含量明显升高[7]。在癌症相关研究中，发现PDHB基因的过表达能够促使丙酮酸代谢进入三羧酸循环(TCA)过程，而不是糖酵解过程，进而抑制细胞的生长和迁移，从而可以减缓癌症进程[8-11]。近年来，也有研究表明，PDHB基因的表达水平与肌内脂肪(IMF)含量呈正相关。通过对大理石纹含量高和低的两组牛骨骼肌进行差显PCR(ddPCR)分析，发现PDHB基因的表达存在显著差异[12]。在对猪IMF的研究中，也发现PDHB基因的表达水平与IMF呈正相关[13]。在对瘦肉型和脂肪型北京鸭的肝脏进行蛋白质组学比较研究发现，PDHB基因的蛋白表达量存在显著差异[14]。我们的前期研究中也发现：在瘦肉型(长白猪)和脂肪型(蓝塘猪)猪中的PDHB基因的蛋白表达量存在显著差异[15]。因此，我们推测PDHB基因可能在肌内脂肪的形成过程中起着重要的作用。我们还对牛PDHB基因的启动子进行研究，发现CCAAT增强子结合蛋β和肌细胞生成素很可能是调控该基因表达的关键转录因子[16]。

目前，关于PDHB基因在牛前体脂肪细胞分化过程中的功能尚不清楚。本研究拟采用秦川牛背最长肌组织作为试验材料，克隆秦川牛PDHB基因。利用AdEasy-1系统构建牛PDHB基因的高滴度重组腺病毒，从而能够持续稳定的表达该基因,为研究该基因在牛肌内前体脂肪细胞分化过程中的功能提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验用到的cDNA是以24月龄秦川公牛背最长肌提取RNA后反转录而来的(由本实验室保存)；腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV、含有骨架载体pAdEasy-1的E.coliBJ5183菌株、HEK 293A细胞均由本实验室保存；DMEM培养基、琼脂糖、胰蛋白酶Trypsin 0.25% EDTA、脂质体LipofectaminTM2000、胎牛血清FBS均购自美国invitrogen公司；Top10-gold感受态细胞、质粒小提中量抽提试剂盒、无内毒素大提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自天根生化科技有限公司；Trans2K Plus II DNA Marker购自北京全式金生物公司；pGEM-T Easy载体、DNA T4连接酶购自Promega公司；DL2000 Marker、λ-HindⅢ digest marker、KOD高保真DNA聚合酶、荧光定量PCR试剂盒、限制性内切酶PmeⅠ、PacⅠ、KpnI和NotI均购自大连宝生物(TaKaRa)公司；DNA引物合成和测序均由上海英潍捷基贸易有限公司完成。

1.2 方 法

1.2.1 秦川牛PDHB基因的克隆 根据牛PDHB基因mRNA(GenBank Accession No.NM_001035435)序列，用Primer 5.0软件设计引物。引物序列为PDHB-F：AGATGGCGGTGGTTGCTGTG；PDHB-R：ATTAAAAGGTCTTATGGGAT，PCR产物大小为1 166 bp。以肌肉cDNA为模板，用KOD高保真DNA聚合酶扩增牛PDHB基因，PCR反应体系(20 μL)为：模板1.2 μL，引物F/R(10 μmol/L)各0.6 μL，KOD酶0.4 μL，10×Buffer 2.0 μL，dNTP Mix 2.0 μL，Mg2+2.0 μL，ddH2O 12.0 μL。反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 10 s，共35个循环；72 ℃终止反应10 min。采用琼脂糖凝胶电泳技术检测PCR产物。用DNA片段回收试剂盒纯化PCR产物，然后连接到pGEM-T Easy载体，接着转化到Top10-gold感受态细胞。挑取阳性克隆扩繁获取菌液，菌液PCR鉴定正确后送测序进行验证。以测序正确的菌液为模板，引物序列为gPDHB-F：GGggtaccAGATGGCGGTGGTTGCTGTG；gPDHB-R：ATAAGAATgcggccgcATTAAAAGGTCTTATGGGAT(小写字母分别为引入的KpnI和NotI酶切位点)，进行亚克隆牛PDHB基因的CDS序列，PCR产物大小为1 080 bp。PCR反应体系同前。反应条件退火温度为62 ℃，其余条件也同前。PCR产物纯化后连接到pGM-T Easy载体，转化后挑取pGMT-PDHB阳性克隆扩繁获取菌液，菌液PCR鉴定正确后送测序进行验证。

1.2.2 腺病毒Ad-PDHB的构建及鉴定 (1)重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-PDHB的构建及鉴定。将pGMT-PDHB重组质粒和pAdTrack-CMV穿梭质粒分别用限制性内切酶KpnI和NotI进行双酶切，回收目的片段后用T4连接酶进行连接，转化到后Top10-gold感受态细胞后挑取pAdTrack-CMV-PDHB阳性克隆扩繁获取菌液，提取质粒后双酶切鉴定。

(2)重组腺病毒质粒pAd-PDHB的构建及鉴定。将pAdTrack-CMV-PDHB重组质粒用PmeⅠ线性化后，酶切产物转化到含有骨架载体pAdEasy-1的E.coliBJ5183感受态细胞。挑取pAd-PDHB阳性克隆，摇菌后提取质粒。用PacⅠ对重组腺病毒质粒pAd-PDHB进行酶切鉴定，将重组质粒转化、涂板、挑取单克隆、菌液鉴定后送测序验证。

(3)腺病毒Ad-PDHB的包装、扩增及滴度测定。取5 μg无内毒素试剂盒提取重组腺病毒质粒pAd-PDHB，用PacⅠ酶切后回收大片段。当HEK 293A细胞生长到80%左右时，按脂质体LipofectaminTM3000说明书2 μg质粒/孔转染，进行重组腺病毒Ad-PDHB包装。将细胞置于含5% CO2的37 ℃培养箱中孵育6 h后换液，待细胞长满培养皿，将细胞传代于25 cm2细胞培养皿中。每天观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况，待细胞长满瓶底时，再传到75 cm2细胞培养瓶中培养，每天观察瓶内出毒迹象，即细胞收缩变圆和脱落情况。转染12～14 d后，当出现明显的细胞病变反应，且有50%以上细胞从培养瓶壁脱落后收集细胞，-80 ℃/37 ℃反复冻融3次，10 000 g离心10 min，收集病毒上清，即为第1代病毒母液P1。将P1病毒再次感染HEK 293A细胞，感染48 h后收集细胞，-80 ℃/37 ℃反复冻融3次，10 000 g离心10 min收集病毒上清，标记为P2。同样方法用P2代病毒感染大量的HEK 293A细胞扩增病毒至P3代。取200 μL的P3代病毒沸水孵育10 min后立即冰浴，短暂离心后取上清用于PCR鉴定模板。PCR鉴定反应体系和条件同1.2.1。将收集的高滴度病毒悬液用绿色荧光蛋白(GFP)标记法测定病毒滴度的方法[17-18]。

1.2.3 重组腺病毒Ad-PDHB的活性鉴定 当牛肌内前体脂肪细胞生长到80%左右时，分别侵染高滴度病毒Ad-PDHB和Ad-EGFP。侵染48 h后观察绿色荧光表情况，收集细胞提取总RNA，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测PDHB基因的表达情况。定量引物为PDHB-RT-F：TCTGAGATGGGCTTTGCTGG，PDHB-RT-R：TGACCTGGTCGATGGCTTGC，PCR产物大小为109 bp。以牛GAPDH基因(Accession No. NM_001034034)作为内参，引物为：GAPDH-RT-F：CCAACGTGTCTGTTGTGGAT，GAPDH-RT-R：CTGCTTCACCACCTTCTTGA[19]，PCR产物大小为80 bp。

2 结果与分析

2.1 秦川牛PDHB基因的克隆及鉴定

通过克隆获得条带单一的PCR产物大小为1 166 bp(图1)，胶回收后连接到pGM-T Easy载体，经测序验证，目的基因与数据库GenBank收录的序列一致。设计带酶切位点的引物，进行亚克隆获得1 080 bp的条带单一的PCR产物(图2)，即为牛PDHB基因的CDS序列，胶回收后连接到pGM-T Easy载体，进一步测序验证无误。说明牛PDHB基因克隆成功，可进行下一步实验。

注：M为DL2000 DNA marker；1-2为PDHB基因PCR产物。

注：M为DL2000 DNA marker；1为PDHB基因CDS序列>PCR产物。

2.2 重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-PDHB的鉴定

限制性内切酶KpnI和NotI双酶切pAdTrack-CMV-PDHB质粒，得到大小分别约为9 kb和1 kb的两条条带(图3)，符合预期。说明重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-PDHB构建成功，可与腺病毒骨架载体重组。

注：M为Trans2K Plus II DNA Marker；1为双酶切产物。

2.3 腺病毒重组质粒pAd-PDHB的鉴定

将经PmeⅠ酶切线性化的穿梭质粒pAdTrack-CMV-PDHB转化到含有pAdEasy-1的E.coliBJ5183感受态。提取质粒后PacⅠ酶切鉴定，电泳检测到两条大小分别约为30 kb和4.5 kb(图4)的电泳条带，初步证明腺病毒重组质粒pAd-PDHB重组成功。后经测序验证，表明pAd-PDHB重组成功，可进行下一步的腺病毒包装实验。

注：M为λ-HindⅢ digest marker；1为PacⅠ酶切产物。

2.4 腺病毒Ad-PDHB的包装、扩繁及滴度测定

将经PacⅠ酶切线性化后的30 kb左右的大片段胶回收后，转染HEK 293A细胞。转染24 h，Ad-PDHB在荧光显微镜下已能看到少量细胞开始出现绿色荧光；10 d时，绿色荧光数明显增多，视野变亮并在局部出现葡萄串样荧光聚集，呈彗星状；13 d时，绿色荧光铺满整个视野，大量细胞病变脱落，出现明显的空斑(图5)。而空白对照组Ad-EGFP，转染24 h时也出现绿色荧光；7 d时，呈现彗星状；11 d时，大量细胞病变脱落，出现明显的空斑(图5)。反复感染HEK 293A细胞3次后获得高滴度病毒。滴度病毒用绿色荧光蛋白(GFP)标记法测定病毒滴度，滴度为1.66×109PFU/mL。

图5 重组腺病毒Ad-PDHB的包装

2.5 病毒活性鉴定

重组腺病毒Ad-PDHB感染牛肌内前体脂肪细胞48 h后，观察到大量的绿色荧光(图6)，表明病毒感染效率较高。收集细胞后，实时荧光定量PCR检测结果表明感染腺病毒Ad-PDHB的PDHB基因表达量比对照组Ad-EGFP高25.5倍(图7)。

注：A为重组腺病毒Ad-PDHB；B为对照组Ad-EGFP；C为空白对照。

图7 牛PDHB基因在感染48 h的相对表达水平

3 讨 论

IMF含量是影响肉质的重要因素之一，对肉的风味、多汁性和嫩度都有影响[16,20]，而PDHB基因的表达水平又与IMF含量呈正相关[12-15]，因此PDHB基因很可能是影响肌内脂肪含量的重要候选基因。在前期研究中，我们已对牛PDHB基因的转录调控机制进行了初步研究，发现C/EBPβ和MYOG很可能是调控牛PDHB基因表达的两个重要转录因子[16]。

本研究首先通过设计特异引物，将牛PDHB基因克隆出来，然后再通过设计带酶切位点的引物进行亚克隆获得牛PDHB基因的CDS区，采用此方法可以有效提高克隆的效率[21-23]。目前，将外源基因导入真核细胞表达的载体主要有两类。一类是非病毒表达载体系统，常见的为pCDNA3.1(±)非融合性真核细胞表达载体，其优点是安全性高、毒性小、外源基因长度不受限制，缺点为效率较低，在细胞中属于瞬时表达，表达时间较短[24]；另一类是病毒表达载体系统，常见的有慢病毒(属于逆转录病毒)表达载体系统和腺病毒表达载体系统。慢病毒表达载体系统的优点是可将外源基因整合到靶细胞基因组，持久稳定地表达外源基因，缺点为可引起人获得性免疫缺陷症，因此对实验室的安全级别要求较高[25]。腺病毒表达载体系统的优点是产生的病毒颗粒比较稳定，装载量大(可插入约10 kb的外源基因)，对人的致病性低，且能将外源基因在靶细胞中持续表达10 d以上[26]。本研究中使用的AdEasy腺病毒表达载体已在基因的功能研究中广泛应用[27-28]。

本研究通过构建秦川牛PDHB基因的腺病毒过表达载体系统，为接下来研究PDHB基因在牛前体脂肪细胞分化过程中的作用奠定了实验基础。

4 结 论

成功构建了秦川牛PDHB基因的重组腺病毒表达载体，重组腺病毒Ad-PDHB能够在牛肌内前体脂肪细胞中过表达PDHB基因。