丙酰化淀粉多尺度结构及消化特性表征

汪芬芬，姚轩，王静，周中凯

（天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457）

淀粉是一种植物多糖，来源广泛，通常存在于谷物（如小麦淀粉、玉米淀粉）、块茎（如木薯淀粉、马铃薯淀粉）以及根、果实（如葛根淀粉、豆类淀粉、香蕉淀粉）中，是地球上丰富的可再生生物资源之一[1]。淀粉作为人们日常饮食的主要碳水化合物，也是人体能量供给的主要来源[2]，根据营养片段，可以划分为快速消化淀粉（readily digestible starch，RDS）、慢速消化淀粉（slowly digestible starch，SDS）以及抗消化淀粉（resistant，RS）[3]。由于淀粉具有成本低、资源丰富、可生物降解等特点，因此常被用于食品和非食品工业中，生产出来的淀粉中约57%用于食品消费，43%用于非食品工业[4]。在食品工业中，淀粉可用于增稠、成膜、封装、保湿和延长货架期等；在非食品工业中，淀粉可用于造纸、黏合剂、钻井液黏度改性剂、生物可降解塑料、纱线上浆剂、药物载体等[5]。然而天然淀粉的一些物理特性，如亲水性强、机械性能差[6]、保质期短、稳定性差[4]、成膜性能差[5]等限制了其在某些领域的应用。淀粉改性是克服这些特性的有效途径，主要包括：化学改性、物理改性、酶修饰以及基因改造[7]，化学改性应用最为普遍。化学改性是将新的官能团引入淀粉分子，取代无水葡萄糖单元上的羟基，从而改变其物理化学性质[7]，主要包括酯化反应、醚化反应、氧化反应、交联反应[8]，其中酯化反应是一类重要的化学改性手段[9]。与天然淀粉相比，酯化淀粉具有良好的耐热性、疏水性、成膜性，可用于乳液、药物辅料、疏水性材料等，如辛烯基琥珀酸酐酯化淀粉可用于药物和营养物质的包封、生物活性食品成分的载体和食品乳液稳定剂[10]。低取代度（degree of substitution，DS）的乙酰化淀粉比天然淀粉更适合作为增稠剂和稳定剂，而高取代度的乙酰化淀粉更耐消化，可以作为口服结肠剂靶向药物载体材料[11]。酰化淀粉中，丙酰化淀粉因其良好的抗消化性而备受关注，但对其研究较少。抗性淀粉在小肠中不被消化，在大肠中被微生物分解产生短链脂肪酸，丙酸是短链脂肪酸的关键成分之一。

研究表明，长期补充丙酸可以降低血糖，丙酰化淀粉可能为丙酸进入肠道提供一种新的载体[12]。因此本文制备3种取代度丙酰化淀粉，采用傅里叶红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）、核磁共振氢谱（nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum，1HNMR）、X 射线衍射（X-ray diffraction，XRD）等技术对丙酰化淀粉进行结构表征，利用扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）观察淀粉外观形态的变化，并对其热稳定性、疏水性和消化特性进行探讨，为丙酰化淀粉进一步研究与开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

木薯淀粉（食品级）：天津文星淀粉有限公司；丙酸酐、对甲基苯磺酸（均为分析纯）：天津利安隆博华医药化学有限公司；胃蛋白酶P110928（≥15 000 NFU/mg）、α-淀粉酶 A109181（≥500 KNU-B/g）、葡萄糖淀粉酶 A107823（1×105U/mL）、中温淀粉酶A109181（1×104U/mL）：阿拉丁试剂有限公司；葡萄糖试剂盒：长春汇利生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

扫描电镜（JSM-IT500HR）：日本株式会社；傅里叶红外光谱（Is50）：赛默飞世尔科技公司；粒度分布仪（Better2600）：丹东百特仪器有限公司；接触角（PGX）：德国FIBRO公司；热重分析仪（Q50）：美国热分析仪器公司；X射线衍射仪（X-ray-6100）：日本岛津公司；烘箱（GZX-9146MBE）：上海博讯实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 丙酰化淀粉的制备

参考Filippo等[5]的方法并稍加修改制备丙酰化淀粉。将完全干燥的10 g木薯淀粉与30 mL丙酸酐混合，置于智能磁力搅拌器加热，然后将用丙酸酐完全溶解的对甲基苯磺酸加入溶液，分别在90、100、120℃下反应4 h。反应完成后，待反应溶液冷却至室温25℃，用4℃蒸馏水反复洗涤，除去多余的酸酐和催化剂，并通过布氏漏斗真空过滤分离得到固体产物。固体产物于45℃烘箱中干燥24 h、粉碎、过100目筛，即可得丙酰化木薯淀粉，并命名为NTS（天然淀粉）、PTS-1（取代度为0.81的丙酰化淀粉）、PTS-2（取代度为1.53的丙酰化淀粉）、PTS-3（取代度为2.67的丙酰化淀粉）。

1.3.2 丙酰基含量和取代度的测定

丙酰基含量和取代度根据Tupa等[13]的方法测定。称取1 g淀粉置于250 mL锥形瓶中，加入30 mL 75%乙醇，然后置于50℃、150 r/min摇床上预热30 min。依次加入3滴酚酞和0.02 moL/L NaOH，使溶液呈微碱性，然后加入30 mL 0.05 moL/L NaOH，于25℃、150 r/min条件下反应4 h。反应结束后，以酚酞作为指示终点，用0.05 moL/L HCl滴定剩余的碱，并记使用的HCl体积为VS。天然淀粉作为空白对照，所用HCl体积为VB。丙酰基含量和取代度的计算公式如下。

式中：Pc和DS分别为丙酰基含量和取代度；m为样品质量，g；36.5、57和162分别为盐酸、丙酰基和葡萄糖的相对分子质量。

1.3.3 淀粉的形态观察

淀粉颗粒的表面形貌通过扫描电镜观察。干燥的天然淀粉和丙酰化淀粉用导电胶带固定在圆形铝板上，并涂上一层薄薄的金箔，以避免成像过程中静电积聚。将镀金后的样品放在显微观察室中，对其观察并拍照。

1.3.4 红外光谱分析

将干燥的天然淀粉和丙酰化淀粉分别与KBr按1∶150（质量比）混合并压片1 min。在波长范围为4 000 cm-1～400 cm-1、分辨率为 4 cm-1条件下进行 32 次扫描，采集所得光谱即样品的光谱图。

1.3.5 X射线衍射分析

天然淀粉和丙酰化淀粉的X射线衍射谱图可通过X射线衍射仪分析获得。扫描范围为5°～45°、扫描速度为 2°/min。

1.3.6 核磁共振氢谱分析

称取天然淀粉和丙酰化淀粉各10 mg于1.5 mL离心管中并加入0.5 mL二甲基亚砜，在85℃下水浴10 min使其充分溶解。然后将溶液全部转移到核磁管中，在25℃下进行32次扫描。

1.3.7 消化特性测定

称取天然淀粉和丙酰化淀粉各200 mg与300 μL唾液淀粉酶（60 μL α-淀粉酶溶解于 5 mL CH3COOHCH3COONa缓冲溶液，pH5.0）混合，在 37℃、100 r/min条件下搅拌反应5 min，模拟口腔消化；然后加入15 mL胃蛋白酶（胃蛋白酶溶解于0.02 moL/L HCl，浓度为1 mg/mL）持续反应30 min，模拟胃液消化；之后再加入15 mL 0.02 moL/L NaOH、25 mL CH3COOH-CH3COONa缓冲溶液和10mL复合酶（由2 400 μL中温α-淀粉酶、400 μL 葡萄糖淀粉酶组成，CH3COOH-CH3COONa缓冲溶液定容至200 mL）继续反应。在0、20、120min分别取1 mL水解液，煮沸10 min使酶灭活。在10 000 r/min、4℃条件下离心10 min，用葡萄糖试剂盒测定上清液中的葡萄糖含量，计算RDS、SDS和RS含量公式如下。

式中：FG为游离葡萄糖含量，mg；G20和G120分别为水解20 min和120 min后的葡萄糖含量，mg；TS为样品的总淀粉含量，mg；0.9为淀粉与葡萄糖的转化率。

1.3.8 热稳定性分析

天然淀粉和丙酰化淀粉的热稳定性通过热重分析仪测定。称取5 mg样品放置在已去皮的铝盘上，在25℃～600℃、加热速度20℃/min、氮气加热速度30 mL/min程序下进行测定。

1.3.9 疏水性分析

天然淀粉和丙酰化淀粉在20 MPa压力作用下形成直径约1.5 cm的圆形压片，通过动态接触角测试仪测量接触角。在压片表面注入3 μL蒸馏水，形成的液滴不再扩散即可通过计算机软件确定接触角。

1.4 数据分析

所有试验均进行3次，结果表示为平均值±标准差。使用Origin 9.0和SPSS 18.0进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 丙酰化淀粉的丙酰含量和取代度

丙酰化淀粉的丙酰基含量和取代度见表1。

表1 丙酰化淀粉的丙酰基含量和取代度Table 1 The propionyl contents and degree of substitution of propionylated starch

如表1所示，丙酰基含量和取代度随着温度的升高而增大，丙酰基含量从22.36%增加到48.88%，取代度从0.81增加到2.67。这是由于高温加速了淀粉分子与丙酸酐的扩散速度，促使葡萄糖单元羟基不断与丙酸酐结合，导致取代度增大[13]。在丙酰化过程中，淀粉葡萄糖单元上的3个游离羟基被取代，因此理论上取代度最大值为3[5]。由于3种游离羟基的反应活性不同，与C2和C3上羟基相比，C6上的羟基更活泼，更容易丙酰化[14]；丙酰化反应是不均一的，导致某些葡萄糖单元不能完全接触到丙酸酐[15]，因此取代度小于3。

2.2 淀粉颗粒形态观察分析

天然淀粉及丙酰化淀粉的电镜图见图1。

图1 天然淀粉及丙酰化淀粉的电镜Fig.1 Scanning electron microscope of native and propionylated starches

由图1可知，天然淀粉的表面光滑饱满，颗粒尺寸大小不一，大颗粒主要呈现为圆球形，一些小颗粒相互簇拥主要表现为不规则的多边体。经过丙酰化处理，淀粉颗粒形态被破坏，并且随着取代度的增加，其被破坏程度加剧。PTS-1表面开始变得粗糙，这是由于丙酰基含量增加[11]，进一步反应使得淀粉颗粒出现凹坑、聚集、破碎现象，PTS-3的淀粉颗粒完全被破坏。研究表明，分子间氢键相互作用的减少和加热作用破坏了样品的结晶度，导致淀粉颗粒形态发生改变[8]。

2.3 淀粉颗粒结构分析

2.3.1 红外光谱分析

天然淀粉及丙酰化淀粉的红外光谱图见图2。

图2 天然淀粉及丙酰化淀粉的红外光谱Fig.2 Fourier Infrared spectroscopy of native and propionylated starch

由图2可知，天然淀粉表现出典型的多糖结构，即在3 416、2 932 cm-1和1 647 cm-1处存在吸收峰，分别代表淀粉分子的O-H拉伸振动、C-H不对称拉伸振动和水分子中O-H弯曲振动吸附[5]。与天然淀粉相比，丙酰化淀粉在2 984、1 740 cm-1出现新的吸收峰，分别归因于丙酰基的亚甲基（C-H）拉伸和酯羰基（C=O）的延伸，证明发生了丙酰化反应。此外，从图2可以观察到随着取代度的增大，丙酰基特征峰的强度也在增大，而在3 416 cm-1处的羟基峰值强度下降，这表明淀粉分子中的羟基逐渐被取代，使得分子间或内氢键减弱[16]。

2.3.2 晶体结构分析

天然淀粉及丙酰化淀粉的X射线衍射图见图3。

图3 天然淀粉及丙酰化淀粉的X射线衍射Fig.3 X-ray diffraction patterns of native and propionylated starches

淀粉颗粒具有独特的半结晶体系，由非结晶区和结晶区交替组成[17]。根据X射线衍射图中不同衍射峰的强度和位置，淀粉的结晶类型可分为A型、B型、C型和V型[1]。天然淀粉表现为典型的A型晶体结构，衍射峰在 15.23°、17.08°、17.96°和 23.17°左右，其中 17.08°和17.96°为未接受的双峰[8]；与天然淀粉相比，丙酰化衍射峰的相对强度随着取代度的增加而逐渐减小，相对结晶度也逐渐减小。当取代度增加到2.67时，其X射线图在20°附近显示典型的宽峰，说明丙酰化破坏了天然淀粉的有序结晶结构[15]，这是因为丙酰基的引入会限制淀粉分子的活性，破坏天然淀粉分子链的规律性，从而削弱了分子间的氢键作用，导致晶体结构被破坏[11]，而在低 2θ 范围（6°～8°）内出现新的衍射峰则表明取代度为2.67的丙酰化淀粉有新的晶体结构产生，这与Xu等[18]的研究结果一致。Filippo等[5]的研究也提到酰化反应先发生在非结晶区域，然后继续发生在结晶度较高的区域。

2.3.3 核磁共振氢谱分析

天然淀粉及丙酰化淀粉的核磁共振氢谱图见图4。

图4 天然淀粉及丙酰化淀粉的核磁共振氢谱Fig.4 Nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum of native and propionylated starches

2.5 ppm和3.3 ppm处对应的化学信号分别是溶剂DMSO-d6和水分子的质子吸收峰[9]。由图4可知，位于5.50、5.40、4.58 ppm的化学信号分别代表淀粉中无水葡萄糖单位上C3、C2和C6的羟基质子峰，5.10 ppm、3.3 ppm～3.8 ppm 处的化学信号是 C1、C2～C6的质子峰。而在丙酰化淀粉光谱中，取代度为0.81时，在3.29 ppm～3.65 ppm范围内的信号显示，由于只有部分羟基参与了修饰，仍能观察到葡萄糖无水单元的峰特征，在5.44 ppm、4.58 ppm时，羟基的质子比与天然淀粉相似；DS为1.53和2.67时，无水葡萄糖单元中羟基的信号消失，质子的化学环境与天然淀粉完全不同且丙酰化淀粉在2.2 ppm和1.0 ppm处出现了新的质子吸收峰，分别是新引入的亚甲基和甲基，证明丙酰化是成功的[18]，并且随着取代度的增加，甲基峰和亚甲基峰的强度增加。

2.4 消化特性分析

天然淀粉及丙酰化淀粉的消化特性见表2。

表2 天然淀粉及丙酰化淀粉的消化特性Table 2 Digestion characteristics of native and propionylated starches

由表2可知，天然淀粉的RDS、SDS、RS含量分别为70.37%、16.38%、13.25%。随着取代度的增加，丙酰化淀粉的RDS含量逐渐降低，RS含量逐渐增加，与天然淀粉相比，其RS含量分别提高了4.07%（PTS-1）、19.18%（PTS-2）、69.06%（PTS-3），表明高取代度的丙酰化淀粉对酶的抗性更强，这可能是因为丙酰基的引入导致空间位阻增加，延迟了酶与淀粉分子的接触[19]。

2.5 热稳定性分析

天然淀粉及丙酰化淀粉的热重分析图见图5。

图5 天然淀粉及丙酰化淀粉的热重分析Fig.5 Thermogravimetric analysis of native and propionylated starches

热重分析常用来评价淀粉的热稳定性[20]。由图5可知，第一个阶段（30℃～125℃），天然淀粉（8.58%）和丙酰化淀粉（PTS-1：8.97%，PTS-2：3.71%，PTS-3：3.73%）的失重主要是由于水分蒸发[20]。对于天然淀粉，330℃～360℃观察到第二次失重，并将其归因于淀粉热分解[21]。而丙酰化淀粉在第二阶段出现了两个峰，分别是由羟基未被取代的天然淀粉分子（210℃～380℃）和丙酰化淀粉分子（390℃～430℃）的热分解形成，并且随着取代度的增加，第一个峰的强度减小，第二个峰强度增加。丙酰化淀粉比天然淀粉热稳定性更强，这主要是因为丙酰化后剩余的羟基数量更少[22]。

2.6 疏水性分析

天然淀粉及丙酰化淀粉的接触角测量图见图6。

图6 天然淀粉及丙酰化淀粉的接触角Fig.6 Contact angle of native and propionylated starches

接触角是测量液体在材料表面润湿性的重要参数[23]。由图6可知，当水滴加到天然淀粉压片表面时，立马吸水膨胀裂解，测得接触角为5.33°，说明天然淀粉亲水性很强。当取代度为0.83、1.54和2.73时，丙酰化淀粉的接触角分别为 75.97°、81.67°和 65.53°，结合红外光谱结果分析，表明在丙酰化反应中，疏水性酯羰基通过取代部分亲水性羟基而连接在淀粉分子上，从而导致接触角增加。此外，随着取代度的增加，接触角呈先升高后降低的趋势。这是因为当取代度为0.81和1.53时，丙酰基和羟基会形成分子内氢键，此时甲基和亚甲基在疏水界面的生成中起重要作用。而当取代度为2.67时，羰基化合物会和水分子形成分子间氢键，导致疏水性减小，因此这个样品的接触角小于取代度较低的样品[18]。

3 结论

本文以木薯淀粉为原料，丙酸酐为酯化剂，对甲基苯磺酸为催化剂，反应温度为变量制备了取代度分别为0.81、1.53、2.67的丙酰化木薯淀粉，同时对这些淀粉进行了结构表征。结果显示，经过丙酰化反应，FTIR中1 746 cm-1处出现的酯羰基及1HNMR中1.0 ppm和2.2 ppm处出现的甲基和亚甲基吸收峰，证实了淀粉分子上成功引入丙酰基，且随着取代度的增大，丙酰基的特征峰强度增强。另外，位于3 416 cm-1处的葡萄糖单元上的羟基峰减弱，表明了羟基被丙酰基取代，分子间或内氢键相互作用减弱，从而导致淀粉热稳定性和疏水性的提高。XRD的结果显示，木薯淀粉的结晶类型为A型，经过丙酰化反应，随着取代度的增大，结晶度逐渐减小，A型晶体结构也逐渐被破坏。从SEM中也观察到随着DS的增大，淀粉颗粒表面变得粗糙并出现破碎现象。此外，淀粉经丙酰化处理后，抗消化特性显著增强。以上结果说明此方案设计合理，可以准确评价丙酰化淀粉的有效性，不仅为将来开发新型变性淀粉提供了理论依据，也为淀粉的应用提供了充分的参数和新途径。