结核分枝杆菌的检测及分子生物学技术应用研究

杜磊

（河口县人民医院检验科，云南 河州 661300）

当前我国针对肺结核疾病的治疗原则是尽早诊断，及时隔离、积极治疗控制，在基本政策下，虽然患病数量总体呈现下降趋势、治愈率不断提高，但是肺结核疾病在我国公共卫生体系中始终不容忽视，因为肺结核疾病传染渠道简单，可通过空气完成传播，免疫系统能力差的群体极易感染，加上近年来我国老年人群数量不断上升，结核病疾病发病率始终十分严峻[1-2]。过往常见的分歧杆菌诊断办法通畅以快速培养计数检查作为重要手段，方法主要依靠结合分歧杆菌极短的生长周期，将痰液进行分离后进行培养，该实验组理论简单，但实际过程较为繁琐，在多个过程中可能会出现外界感染的情况，从而影响了最终结果。随着检测技术的发展，当前我国针对结合分歧杆菌的诊断方式多样，包括细菌学检测方法、免疫学检测方法、噬菌体生物扩增法、分子生物学检测方法等[3]。在诸多检测方法中，PCR是应用较为广泛且准确性极高的一种诊断方法，相较于细菌学检测中图片与染色检查等方法，PCR技术操作更为方便，时至今日，分子生物学技术在肺结核诊断中的应用已经不可缺少[4]。本文以PCR检测技术为例，与图片染色检查法进行对比，评价分子生物学技术的应用效果与价值，内容如下。

1 资料与方法

2.1 一般资料

综合研究标准与排除标准从2020年6月至2021年6月时间段内在我院接受检查治疗的疑似肺结核患者中选取220例为研究对象，入选研究对象男女比116/104，患者年龄28 ～81（45.6±12.9）岁。所有患者均出现不同程度的结核病疑似症状，患者知晓本次研究的两种检查方法，事先进行健康知识宣教，患者知悉且同意研究，研究经伦理会通过。

2.2 方法

对照组数据来源于常规痰涂片检测，检测方法概述如下：集中收集患者痰液样本，按照操作规定进行检测，接种环挑取适量痰液样本，制作厚膜涂片，规格为15 mm*20 mm。等待涂片自然干燥，随后采用火焰进行固定。染色材料选用石碳酸复红染液，应用盐酸溶液（3%）脱色处理。滴加染色后采用吕氏美蓝液再次进行染色操作，持续时间30 s，涂片予以复染色2 min，确定样本可用后按照抗酸染色镜检结果进行分级观察，确定涂片阴阳性。

实验组数据来源于PCRDNA检查办法，检测方法概述如下：收集痰液样本，在痰液样本中适量加入等体积液化液，充分震荡混合，在37℃条件下持续液化，持续时间为30 min，最终获得液化样本。随后抽取液化样本约1 mL，置于离心管。设置离心数据：离心速度为12000r/min，离心时间为5 min，确定离心效果。去除上清液后，继续添加1 mL生理盐水到离心管中，持续震荡，再次进行离心处理，设置离心数据：离心速度为12000 r/min，离心时间为5 min，再次清除上清液。次予以清除上清液。提取阶段:离心管内加人60μL和旋提取液,充分涡旋振荡并混合后,转人至核酸提取试管内，开启核酸快速提取设备,充分振荡5 min,准备95℃的水,核酸提取管水浴5 min,取出后离心处理60 s,获取核酸,抽样2μL予以扩增实验并记录。置ABI7000荧光定量PCR仪上运行PCR程序。PCR扩增参数：反应管在93C保温2 min,先按93℃45 s→55℃60 s循环10次，再按93℃30 s→55℃45 s循环30次，荧光检测在第2次循环55℃45 s时完成。根据说明书的结果判断标准进行结果分析。

1.3 观察指标

（1）阳性率：参照各检查方法诊断依据进行阳性率判断；（2）准确率：参照细菌培养结果确定准确率。

1.4 统计学方法

将数据纳入SPSS 23.0软件中分析，计量资料比较采用t检验，并以（±s）表示，率计数资料采用χ2检验，并以率（%）表示，（P＜0.05）为差异显著，有统计学意义。

2 结果

2.1 阳性率

患者在经过两种不同方法检查后，根据数据可知PCR检查方法检出阳性率显著更高，对比常规图片检查方法有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 阳性率[n（%）]

2.2 准确率

参照细菌培养结果，实验组数据准确率明显更高，对比对照组数据有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 准确率[n（%）]

3 讨论

结核分歧杆菌能够直接引起的人类疾病为结核病，该疾病具有显著传染性，目前已经是我国卫生系统重点防治的疾病之一，疾病传染性具有全年龄段、多器官入侵的特点，其中以肺部感染最为显著。目前临床研究表明，最直接的传播途径为呼吸道传染，目前我国城市人口密度不断增加，结核分歧杆菌的传染率相较于以往更高，对于医疗系统而言有效诊断并且阻断其传播对于疾病防控有重要意义[5]。虽然我国当前医疗卫生条件不断发展，居民健康知识水平不断提高，结核病仍然是我国形势严峻的公共卫生问题，有数据显示，2020年中国肺结核发病数为670538人，同比下降13.6%，2020年中国肺结核死亡数为1919人，同比下降35.8%[6-7]。虽然结核病疾病防治整体效果显著，但由于结核病传播渠道简单，疾病的诊断与控制始终是不可松懈的环节。

目前认为，针对结核病疾病的防治应当分为诊断+防治结构建设两个步骤，我国应用的“三位一体服务模式”在结核病的防治中效果理想，通过定点医院实施三位一体服务模式是我国定点医院最重要的执行基础[8]。作为定点医院，应当有明确的管理组织，选取分管院长为管理人员，同时应当纳入公共卫生科相关成员共同组成管理协调小组，首先明确院内工作，建立起联合放射科、门诊、公共卫生科等部门的联合工作制度，落实工作职责，明确医院内部的等级、转诊程序以及报告工作流程，在联合部门中落实结核病患者登记本工作，明确负责结核病治疗科室，实现院内发现，院内转诊的一体化防止工作制度[9]。同时院内有效建立结核病的监督机制，定期考核相关科室的结核病报告、转诊情况，定期进行系统通报。而在疾病的诊断中，早期开展有效筛查并实施治疗是保证患者康复、降低疾病传染率的重要前提，在常规检测中，细菌检测法十分常见，涂片检查法是操作简便，价格低廉，性价比高，是肺结核筛查的重要方法，但是在大量应用中，我们发现该办法的阳性检出率逐渐不能满足临床的诊断治疗要求，更有效的检查方法亟待应用[10-11]。

在过去，快速培养试验、X-pert诊断等方法较为常见。快速培养试验主要是利用24 h痰液进行培养后应用分析仪得出诊断结果，该实验虽然简单直接，但是过程相对比较繁琐，同时容易受到其他细菌污染，影响了实验结果。X-pert诊断则是半巢式实时荧光定量PCR体外诊断技术系统，将灌洗液和试剂按照2：1的比例进行混合，通过试剂盒之后放入Gene-pert检测系统中，对样品进行洗涤与过滤，通过超声将样品的核酸进行稀释，当核酸DNA和PCR试剂充分混合之后再进行扩增，随后呈现出相关的结果[12]。随着分子生物学技术发展分子生物学技术是今年各大实验室常用的一种检查方法，该类技术包括核酸扩增检测（NAAT）、PCR技术、DNA指纹图谱技术、基因芯片技术、LAMP技术等[13]。PCR技术是1989年Hance等人首先将PCR用于结核分枝杆菌的检测,原理是用各种分枝杆菌特异核苷酸对标本DNA进行扩增,根据扩增产物的特异片段进行鉴定。PCR技术是其他分子生物技术的基础。同时PCR技术该类技术中应用最成熟、灵敏度相对较高、检测较快、特异性较强的检测技术，该技术利用一段DNA为模板，在DNA聚合酶和核苷酸底物共同参与下，将该段DNA扩增至足够数量，以便进行结构和功能分析[14-15]。PCR检测方法在临床上快速诊断细菌性传染病等方面具有极为重要的意义。在本研究中，不同方法检查下，研究组数据来源方法阳性率显著高于对照组数据来源方法，同时对比细菌培养结果确定213例（96.82%）为结核分歧杆菌携带患者，研究组检查方法准确率显著高于对照组检查方法,差异有统计学意义（P＜0.05）。

综上所述，在结核分歧杆菌的检查中，相较于常规痰涂片检查方法，应用PCR分子生物学检查技术能够进一步提高结核病菌的检出率，该方法的应用在临床结核病患者的诊断中起到重要作用，对于各地区的结核疾病控制有着重要意义，值得临床推广使用。