琯溪蜜柚黄酮重结晶工艺优化

胡 阳 郑丽燕 杨远帆 吴锦辉 倪 辉

黄酮类化合物是一类重要的多酚类次级代谢产物，广泛分布于植物中，对果实色泽、风味和营养及植物抗逆性和抗病虫害具有重要影响[1-2]。常见的黄酮类化合物有柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、芸香苷和槲皮素等，其抗氧化和清除自由基功能使其可以应用于生产抗肿瘤、抗炎镇痛、降血糖、免疫调节、抗病毒抑菌等药物及功能性保健食品中[3]。此外，黄酮类化合物还具有一定的颜色和风味，在食品工业中可作为天然食品添加剂(如食用色素、风味改良剂等)用于食品、饮料的生产等[4]。黄酮类物质在医药、食品、化妆品等行业均具有广阔的发展前景和应用潜力[5-6]。

目前，常见的黄酮提取方法有有机溶剂提取法和水提取法等，黄酮类物质精制纯化方法包括色谱法(常压柱层析法、高压制备型HPLC法、高速逆流色谱法)和结晶法等[7]。高丽等[8]利用大孔树脂精制荷叶黄酮，黄酮纯度达55.28%；康彤[9]利用大孔树脂精制甘草黄酮粗品，黄酮纯度为66.8%；江正祥等[10]利用甲醇与异丙醇的混合溶液作结晶溶剂纯化曲克卢丁，纯度可达95%，回收率为75%；刘艳杰[11]利用甲醇反溶剂重结晶法纯化黄酮纯度为99.8%。相比较而言，采用色谱法对黄酮进行纯化设备昂贵、耗时长、溶剂消耗大，而采用重结晶法分离纯化黄酮类物质具有对分离设备要求低、操作简单、溶剂用量少等优点，因此是黄酮产品工业生产中精制纯化普遍采用方法。同时，不同植物来源的黄酮种类及特性不同，溶剂种类、酸碱度、添加量，以及结晶温度和时间等均对黄酮重结晶具有一定影响，进而影响重结晶黄酮的纯度和产量[12]。

相关研究[2]表明，柑橘类水果中含有大量的黄酮类化合物，是人类膳食中黄酮类化合物摄入的主要来源之一，也是食品和准制药工业中黄酮类化合物的主要来源。柚类水果是重要的柑橘类水果，中国柚类水果产量占全球12%左右，仅福建省平和县琯溪蜜柚产量就达到了120万t[13]。柚类水果的残次废果及加工副产物含有橙皮苷、新橙皮苷和柚皮苷等黄酮类物质，含量达1%～6%[14]，是工业化生产黄酮的潜在优质原料。课题组[15]前期已优化建立了柚皮黄酮乙醇提取工艺，提取得率为柚皮干重的4.90%。研究拟在此基础上，进一步优化柚皮黄酮的重结晶工艺参数，并对重结晶产物进行结构和纯度分析，以期为植物黄酮的重结晶精制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

琯溪蜜柚：福建省漳州市平和县；

芦丁(纯度≥95.0%)、九水合硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

无水乙醇：分析纯，天津市大茂化学试剂厂；

甲醇、乙腈：色谱纯，美国Thermo公司；

高速粉碎机：JP-500C型，永康市久品工贸有限公司；

旋转蒸发仪：RE-501型，上海力辰科技有限公司；

酶标仪：Epoch 2T型，美国伯腾仪器有限公司；

超声波清洗机：KQ5200DE型，昆山市超声仪器有限公司；

岛津液相色谱仪：LC-20AT型，日本岛津公司。

1.2 试验方法

1.2.1 柚皮黄酮粗品制备 参照晏幸等[15]的方法并修改。设置提取液料比30∶1 (mL/g)、乙醇体积分数67%、超声频率163 W、超声温度35 ℃，超声时间50 min，提取两次后收集提取液，真空浓缩至粗提液中黄酮质量浓度≥2.0 mg/mL，于4 ℃析出晶体沉淀，过滤，60 ℃烘干后制得黄酮粗品。

1.2.2 重结晶单因素试验

(1) 乙醇体积分数对黄酮重结晶得率的影响：称取0.50 g 黄酮粗品，液料比为30∶1 (mL/g)，乙醇体积分数分别为10%，20%，30%，40%，50%，对黄酮结晶粗品进行超声水浴辅助溶解，离心取上清液，测定其黄酮含量，调节pH值为4.0，4 ℃下进行重结晶，24 h后收集重结晶沉淀，计算晶体重结晶得率。

(2) 液料比对黄酮重结晶得率的影响：称取0.50 g黄酮粗品，液料比分别为10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1 (mL/g)，乙醇体积分数为20%，对黄酮粗品进行超声水浴辅助溶解，离心取上清液，测定其黄酮含量，并调节pH值为4.0，4 ℃下进行结晶，24 h后收集重结晶沉淀，计算晶体重结晶得率。

(3) pH值对黄酮重结晶得率的影响：称取0.50 g黄酮粗品，乙醇体积分数为20%，液料比为30∶1 (mL/g)，对黄酮粗品进行超声水浴辅助溶解，离心取上清液，测定其黄酮含量，并分别调节pH为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，4 ℃下进行结晶，24 h后收集重结晶沉淀，计算晶体重结晶得率。

(4) 结晶时间对黄酮重结晶得率的影响：称取0.50 g黄酮粗品，乙醇体积分数为20%、液料比为30∶1 (mL/g)，对黄酮粗品进行超声水浴辅助溶解，离心取上清液，测定其黄酮含量，并调节pH为4.0，4 ℃下进行结晶，结晶时间分别为6，12，24，36，48 h，收集重结晶沉淀，计算晶体重结晶得率。

1.2.3 响应面试验设计与优化 根据Box-Behnken中心组合试验原则，以单因素试验结果为基础，利用Design-Expert 8.06软件对选定因素进行响应面试验设计、方差分析以及回归分析，获得最佳重结晶工艺。

1.2.4 指标测定方法

(1) 黄酮总含量：参照晏幸等[15]的方法。

(2) 黄酮重结晶得率：按式(1)计算提取液中黄酮重结晶得率。

(1)

式中：

X1——黄酮重结晶得率，%；

m1——重结晶的晶体质量，g；

m0——被结晶物的质量，g。

(3) 黄酮主要成分的HPLC分析：采用Shim-pack GIS C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱对样品进行HPLC分析，进样体积5 μL；流速0.5 mL/min，柱温40 ℃，检测波长284 nm；梯度洗脱条件：0～15 min，35%流动相A(超纯水)、65%流动相B(乙腈)。采用标准品对照确定主要成分含量。

(4) 黄酮纯度：分别取0.02 g柚皮苷标准品、黄酮粗品和黄酮重结晶样品溶解于10 mL乙腈中，定容；过0.22 μm滤膜进行HPLC分析。根据标准品与样品的HPLC峰面积之比，按式(2)计算重结晶样品纯度。

(2)

式中：

X2——黄酮纯度，%；

A1——重结晶晶体的液相峰面积；

A0——标准品的液相峰面积。

1.3 数据处理

采用Excel 2013软件对数据进行平均值、标准偏差的计算和图表绘制；采用RStudio 2022.02.0对数据进行单因素显著性分析；通过Design-Expert 8.06软件进行响应面试验设计与数据方差分析。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数对黄酮重结晶得率的影响 由图1可知，随着乙醇体积分数的升高，黄酮晶体重结晶得率先增大后显著减少，当乙醇体积分数为20%时达最大值2.41%，与林芳等[16]的结论一致，是因为随着乙醇体积分数的上升，乙醇溶液极性下降，黄酮溶解度下降，而低体积分数的乙醇溶液极性更接近于黄酮极性，更有利于黄酮的溶解以及混合液体系的饱和，从而利于晶体的析出。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图1 乙醇体积分数对黄酮重结晶得率的影响Figure 1 Effects of ethanol volume fraction on the recrystallization yield of flavonoids

2.1.2 液料比对黄酮重结晶率的影响 由图2可知，随着液料比的增大，溶液中的黄酮含量和黄酮重结晶得率呈明显下降趋势，当液料比为10∶1 (mL/g)时，重结晶得率达到最大值8.21%。

2.1.3 pH值对黄酮重结晶得率的影响 由图3可知，随着pH值的升高，黄酮重结晶得率先升高后下降，当pH值为4.0时黄酮重结晶得率达最大值8.45%，与甄畅迪等[17]的结论一致，说明酸性条件下更有利于黄酮物质的溶解以及结晶速度的提高。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图2 液料比对黄酮重结晶得率的影响Figure 2 Effects of the liquid-solid ratio on the recrystallization yield of flavonoids

字母不同表示差异显著(P<0.05)图3 pH对黄酮重结晶得率的影响Figure 3 Effects of pH value on the recrystallization yield of flavonoids

2.1.4 结晶时间对黄酮重结晶得率的影响 由图4可知，结晶时间对黄酮重结晶得率的影响与一般规律相同，当结晶时间为24 h时黄酮重结晶得率达8.26%，并趋于稳定，当结晶时间为36 h时达最大值8.47%，但无显著性差异，说明结晶时间为24 h左右，粗品中的黄酮已接近全部析出，考虑到工业生产中的成本与效益，取结晶时间24 h为最优结晶时间。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图4 结晶时间对黄酮重结晶得率的影响Figure 4 Effects of crystallization time on the recrystallization yield of flavonoids

2.2 响应面试验

2.2.1 Box-Behnken设计方案及试验结果 固定液料比为10∶1 (mL/g)，以黄酮重结晶率为响应值，对乙醇体积分数、pH和结晶时间3个因素进行响应面设计，试验因素水平见表1，试验设计及结果见表2。

经Design-Expert 8.06多项拟合回归后，得二次项回归方程为：

Y=-19.703+1.442A+6.479B-0.045C-8.775×10-2AB+2.083×10-4AC+4.292×10-2BC-2.324×10-2A2-7.888×10-2B2-1.571×10-3C2。

(3)

2.2.2 回归模型方差分析 由表3可知，回归模型F=19.97，P<0.05，说明该回归模型显著；一次项A、B、C，交互项AB及二次项A2和B2均具有显著影响(P<0.05)。

表1 响应面试验因素与水平表Table 1 Factors and levels of response surface test

因此，二次项回归方程修订为Y=-19.703+1.442A+6.479B-0.045C-8.775×10-2AB-2.324×10-2A2-7.888×10-2B2。各因素的效应关系为A(乙醇体积分数)>C(结晶时间)>B(pH)。相关系数R2=0.973，变异系数CV=8.31%<10%，表明模型可信且拟合程度良好，试验误差小，可用该模型对黄酮重结晶工艺进行分析、优化和预测。

2.2.3 响应面分析与优化 由图5可知，乙醇体积分数与pH的交互作用对黄酮重结晶率的影响比较显著，与方差分析结果一致。

对二次多项式回归方程进行求导计算，得出黄酮重结晶最优工艺条件为乙醇体积分数24.09%，pH 3.75，结晶时间36 h，预测黄酮重结晶得率最高为9.13%。结合实际生产情况，将其参数修正为液料比10∶1 (mL/g)，乙醇体积分数24%，pH 3.75，结晶时间24 h，重复3次实验测得黄酮重结晶得率为8.76%，与预测值相近，由此验证了响应面法优化所得的黄酮重结晶工艺模型的可靠性和合理性。

2.3 黄酮晶体的初步鉴定

由图6可知，精制黄酮的保留时间与柚皮苷标准品完全对应，由此可以判定黄酮重结晶产物为柚皮苷。经重结晶精制纯化后杂质含量明显减少，说明重结晶精制黄酮粗品的方法具有一定效果。

表2 响应面试验优化设计与结果Table 2 The optimization design and results of response surface test

2.4 黄酮晶体纯度

柚皮中的黄酮类物质有柚皮苷、芦丁、橙皮苷和新橙皮苷，其中柚皮苷和芦丁含量较多[18]。根据标准曲线计算可得精制品中柚皮苷纯度为83.38%，相对于粗结晶样CV=8.31%。

表3 基于黄酮重结晶得率的方差分析结果†Table 3 Analyses of variance results based on the recrystallization yield of flavonoids

图5 各因素交互作用对柚皮黄酮重结晶得率的影响Figure 5 Effects of interaction of various factors on the recrystallization yield of flavonoids from pomelo peel

图6 精制黄酮、黄酮粗品和柚皮苷标准品的HPLC图Figure 6 HPLC diagram of refined flavonoid, crude flavonoid and naringin standard

品，纯度提高了36%。许鹭[19]通过D101型大孔树脂分离纯化柚皮苷3次，经60%乙醇溶液重溶后，得到纯度为92.44%的柚皮苷精制品；项飞等[12]通过乙醇溶液提取黄酮后，经多次重结晶和洗涤得到纯度为70.36%的黄酮化合物；涂招秀等[20]利用大孔树脂—结晶法精制蔓三七叶黄酮，得到纯度为91.8%的黄酮精品。贾冬英[21]采用DM130大孔吸附树脂法粗提柚皮中的柚皮苷后，经3次不同条件的重结晶后，得到柚皮苷精制品纯度为85.07%。试验精制品中柚皮苷纯度与上述报道的纯度对比略低，但相对于多次重结晶，该精制过程步骤简洁，纯度较高。相比于大孔树脂纯化或大孔树脂与重结晶相结合精制黄酮类化合物，该工艺操作简单、省时高效、无污染，提取的黄酮纯度与其他方法无大差别，适用于工业化生产。

3 结论

通过响应面法优化了乙醇重结晶精制黄酮工艺。结果表明，精制黄酮粗品的最优工艺方案为液料比10∶1 (mL/g)、乙醇体积分数24%、pH值3.75、结晶时间24 h。此条件下蜜柚黄酮重结晶率为8.76%，结晶产物主要为柚皮苷，纯度为83.38%。研究尚未更深入地鉴定结晶产物，后续将采用红外光谱、质谱和核磁共振等技术手段作进一步探究，明确细化结晶产物中的黄酮种类。