靶向间皮素的CAR-NK-92对卵巢癌的作用研究

葛 瑶，刘 琦，王春燕，刘淑鹏，程忠平

卵巢癌是妇科恶性肿瘤里致死率最高的肿瘤，大多数患者确诊时已经处于疾病晚期(III-IV期)[1]。目前中晚期卵巢癌患者的治疗原则是以手术治疗为主，辅以紫杉醇和铂类药物的化疗，但对于晚期复发难治的卵巢癌患者疗效有限，仍然需要寻求更有效的治疗方法[2]。近年来，免疫细胞疗法的出现为肿瘤治疗带来了新的方向，而嵌合抗原受体修饰自然杀伤(chimeric antigen receptor engineered-natural killer, CAR-NK)细胞是免疫细胞疗法的新突破。这种特异性的基因改造使得NK细胞获得了特异靶向杀伤肿瘤细胞的能力。理想情况下，CAR靶点一般为肿瘤细胞表面特异性高表达而正常细胞表面低表达的蛋白。间皮素作为一种膜表面糖蛋白，在卵巢癌中高表达，而在正常间皮组织中表达较低[3]。该研究构建了以间皮素为靶点的CAR-NK-92细胞，通过体内外实验分别验证CAR-NK-92细胞对卵巢癌的杀伤作用。

1 材料与方法

1.1 组织样本来源和细胞系2例正常卵巢组织样本和21例卵巢肿瘤组织样本均来自同济大学附属第十人民医院妇产科，本研究经医院医学伦理委员会批准，患者签署知情同意书。4～6 周龄雌性SPF级NCG 小鼠，16～18 g，共计12只，购自江苏集萃药康生物科技有限公司，许可证号：SYXK(沪)2021-0012，合格证编号：NO.202144322。所有方案均经同济大学动物护理和使用委员会批准进行。人卵巢癌细胞SKOV3、OVCAR3及NK-92细胞购自中国科学院上海细胞库，保存于同济大学附属第十人民医院妇产科。OVCAR3-LUC细胞是由荧光素酶慢病毒pSLenti-EF1-Luc2-F2A-Puro-CMV-MCS-WPRE转染OVCAR3细胞获得。

1.2 主要试剂和仪器马血清(horse serum, HS)(货号：16050-122)和胎牛血清(foetal bovine serum, FBS)(货号：10099-141)购自美国Gibco公司；重组人纤维蛋白(货号：GMP-CH38)购自苏州近岸蛋白质科技股份有限公司；PE anti-DYKDDDDK Tag 抗体购自美国Biolegend公司；抗间皮素(mesothelin, MSLN)抗体(货号：A14099)购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)试剂盒(货号：C20301)购自美国英杰生命技术有限公司；干扰素γ (interferon-γ, IFN-γ)检测试剂盒(货号：DIF50C)和肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor, TNF-α)检测试剂盒(货号：DTA00D) ELISA试剂盒购自美国R&D Systems公司；D-荧光素钾盐(货号：40902ES02)购自中国翌圣生物科技股份有限公司。FACSCanto II 流式细胞仪(美国BD公司)。

1.3 细胞培养SKOV3、OVCAR3培养于含10% FBS的1640培养基，NK-92培养于添加0.2 mmol/L 肌醇、0.1 mmol/L β-巯基乙醇、0.02 mmol/L叶酸、200 U/ml白细胞介素-2(interleukin-2, IL-2)、12.5%HS、12.5% FBS和1%青霉素链霉素溶液的MEMα培养基中。

1.4 方法

1.4.1CAR载体的构建 anti-MSLN的序列来自GenBank: AF035617.1，CAR的结构包含了胞内CD137和CD3ζ信号转导结构域，中间段CD8的跨膜区，胞外部分CD8铰链区、Anti-MSLN scFv和Flag结构。与此同时，构建含有GFP荧光蛋白的空载体作为对照。

1.4.2MSLN-CAR-NK-92的构建 使用包装MSLN-CAR载体的慢病毒转染NK-92细胞。转染前1 d，使用人纤维蛋白液包板24孔板，4 ℃冰箱过夜。转染当天用生理盐水将包板洗2次，再向板内加入感染复数(multiplicity of infection, MOI)70的慢病毒悬液、NK-92细胞及MEM培养基，轻轻混匀，放置培养箱5～6 h后补加含有IL-2的培养基继续培养；第2天1 000 r/min离心5 min，换液后继续培养，第4天检测转染效率。

1.4.3流式细胞术检测CAR-NK-92细胞的构建效率 将CAR-NK-92和NK-92细胞离心弃上清液，使用3%牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)重悬后，孵育20 min。使用PE anti-DYKDDDDK Tag流式抗体试剂进行细胞表面染色，孵育30 min，再用PBS洗2次，上机检测。所有样本在FACSCanto Ⅱ流式细胞仪上进行操作，使用FlowJo软件进行分析。

1.4.4细胞毒性实验 把CAR-NK-92、control-GFP(GFP空载慢病毒转染的NK-92)与OVCAR3及SKOV3按照效应细胞 ∶靶细胞为2 ∶1和1 ∶1时共培养4 h，检测上清液中LDH活性(反映细胞毒性)。阳性对照组为加入10 μl裂解液的卵巢癌细胞组，靶细胞对照组为不做处理的卵巢癌细胞组，使用酶标仪检测490 nm处的吸光度判断各组中LDH的活性。NK细胞的毒性计算公式为：裂解率(%)=(实验组吸光度-靶细胞对照组吸光度)/(靶细胞最大裂解吸光度-靶细胞对照组吸光度)×100%。

1.4.5TNF-α及IFN-γ的检测 将CAR-NK-92、control-GFP(GFP空载慢病毒转染的NK-92)与OVCAR3及SKOV3按照效应细胞 ∶靶细胞为10 ∶1共培养4 h，使用ELISA法检测上清液中TNF-α及IFN-γ的表达。

1.4.6免疫组化分析 将组织放入液体石蜡中，冷冻包埋切片。加山羊血清37 ℃温箱中封闭40 min。再加入抗MSLN抗体(1 ∶1 000)孵育，4 ℃冰箱过夜。将石蜡切片放入PBS中洗涤后，孵育二抗(1 ∶10 000)，37 ℃温箱中放置1 h。将石蜡切片放入PBS洗涤后，加SABC和显色剂，苏木精复染，使用正置显微镜观察。使用ImageJ软件对免疫组化结果进行分析。

1.4.7免疫荧光实验 为了检测卵巢癌细胞系OVCAR3和SKOV3上MSLN的表达，依次使用4% PFA和0.5% PBST对OVCAR3和SKOV3进行固定和通透，使用3%BSA封闭30 min，再使用anti-MSLN抗体孵育，放置4 ℃冰箱过夜，第2天使用红色荧光Cy3二抗和DAPI试剂避光染色。使用激光共聚焦显微镜观察OVCAR3和SKOV3上MSLN的表达。

1.4.8体内实验 小鼠饲养在无菌环境中，每天观察小鼠饮食及健康状况，每周记录一次小鼠体质量。在第0天时，将荧光素酶基因标记的OVCAR3细胞消化并用PBS重悬成每毫升悬液中含2×106个细胞，在NCG小鼠腹腔内注射细胞悬液100 μl。在第4天和第11天，分别向小鼠腹腔注射1×107个CAR-NK-92细胞或者NK-92细胞。在此期间，使用活体成像仪观察小鼠腹腔内肿瘤生长情况。活体成像时，将小鼠放入麻醉箱中，使用异氟烷麻醉3 min，腹腔注射配置好的100 μl D-荧光素钾盐，底物注射10 min后进行活体成像检测。

1.5 统计学处理采用Prism 8.0软件和Excel对所有数据进行统计学处理。实验数据均重复3次，结果以均数±标准差(mean±SD)表示。两组数据采用t检验进行比较，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原发性卵巢癌组织和卵巢癌细胞系MSLN的表达免疫组化结果显示(图1A)，MSLN在正常卵巢组织中呈低表达或者不表达，而在卵巢癌组织中呈现高表达。为了更好地评估MSLN在卵巢癌组织中的表达情况，从每个样本随机选取一个视野，按照MSLN阳性和阴性区域所占百分比的高低绘制成柱状图(图1B)，发现MSLN阳性率平均占(63±18.6)%，MSLN阴性率平均占(37±18.6)%，差异有统计学意义(t=4.389，P<0.001)。这说明在原发性卵巢癌组织中，MSLN表达量较高。免疫荧光染色法检测SKOV3和OVCAR3两种卵巢癌细胞系上MSLN的表达情况，使用激光共聚焦显微镜观察发现(图1C)，MSLN在SKOV3和OVCAR3两种细胞系表面呈现高表达。

2.2 CAR-NK-92的制备及体外作用研究CAR结构(图2A)包含了Flag蛋白、anti-MSLN、CD8 hinge、跨膜域及细胞内信号域CD137和CD3ζ序列，其中Flag蛋白作为标签蛋白用来鉴定CAR的表达效率。使用CAR慢病毒和GFP空载慢病毒分别转染NK-92细胞，构建CAR-NK-92 (CAR)和control-GFP。流式细胞术检测发现Flag阳性的CAR-NK-92细胞占比70%左右(图2B)，说明采用的CAR NK转染体系可以达到较高的转染效率，获得纯度较高的CAR-NK-92细胞。

体外杀伤实验结果显示CAR-NK-92、control-GFP与卵巢癌细胞SKOV3和OVCAR3按照不同的效靶比共培养时，CAR-NK-92细胞对靶细胞的裂解率明显强于control-GFP细胞，差异有统计学意义(效靶比2 ∶1：t=16.52，P<0.001)(效靶比1 ∶1：t=32.06，P<0.001)(图2C)，说明CAR-NK-92细胞对卵巢癌细胞起到较强的杀伤作用。

图2 CAR-NK-92的构建及体外作用分析A: MSLN-CAR结构示意图；B: 流式细胞术检测CAR-NK-92细胞所占的百分比；C: CAR-NK-92细胞在效应细胞与靶细胞比例为2 ∶1和1 ∶1时对卵巢癌细胞的细胞毒作用(n=3)；D: CAR-NK-92细胞与卵巢癌细胞共培养后上清液中IFN-γ、TNF-α的含量(n=3)；与Control-GFP组比较：*P<0.05，***P<0.001

细胞因子分泌结果显示，CAR组分泌的IFN-γ平均值高于control-GFP组分泌的平均值，在靶细胞为SKOV3时，差异有统计学意义(t=3.318,P<0.05)。同样，CAR组分泌的TNF-α平均值也高于control-GFP组分泌的平均值，在靶细胞为OVCAR3时，差异有统计学意义(t=2.6,P<0.05)(图2D)，说明CAR NK细胞可以分泌更多的细胞因子来发挥抗肿瘤作用。

2.3 CAR-NK-92的体内抗肿瘤特性小鼠生物荧光成像结果显示，与肿瘤组小鼠和NK-92组小鼠相比，CAR-NK-92组小鼠肿瘤生长较缓慢(图3A)。同时对生物发光成像(bioluminescence imaging, BLI)的数值统计显示，与NK-92组相比，CAR-NK-92组小鼠肿瘤生长速度较缓慢，差异有统计学意义(t=3.547,P<0.001)(图3B)，说明CAR-NK-92具有较好的抗肿瘤作用。对小鼠的体质量进行统计分析显示，在肿瘤注射的第21天后，肿瘤组小鼠和NK-92组小鼠出现了体质量增长缓慢的趋势，而CAR-NK-92组小鼠依然保持较稳定的体质量增长速度(图3C)，说明CAR-NK-92有较强的抗肿瘤作用，可以很好地维持小鼠的状态。

图3 小鼠体内实验验证CAR-NK-92对卵巢癌的作用A: 小鼠活体成像图；B: 小鼠BLI数值统计图(n=4)；与肿瘤组比较：*P<0.05；与NK-92组比较：###P<0.001 ；C: 小鼠体质量变化图(n=4)

3 讨论

卵巢癌是一种恶性侵袭性肿瘤，致死率较高，因此探索新的卵巢癌治疗策略具有重要的临床意义[4]。MSLN作为一种膜表面蛋白，在卵巢癌中特异性高表达，因此可以成为卵巢癌免疫治疗的理想靶点[5]。在本研究中，卵巢癌组织中都检测出了MSLN阳性，而在正常卵巢组织中几乎没有MSLN的表达，同时在两种卵巢癌细胞系上也检测出了MSLN阳性，与之前的研究[6]一致。本研究以间皮素为靶点，使用慢病毒转染的方法构建了CAR-NK-92细胞，具有较强的抗肿瘤作用。其中，CAR结构中包含的CD137和CD3ζ作为NK细胞上的重要分子，对激活NK细胞起着重要的作用[7]；同时高效率的转染提高了CAR-NK-92细胞的纯度，也进一步提高了CAR-NK-92细胞的杀伤作用[8]。此外，在本研究中，CAR介导的杀伤作用伴随着更高水平的IFN-γ和TNF-α的分泌，也进一步证实了CAR能够介导更强大的杀伤作用。而在荷瘤小鼠实验中，CAR组小鼠表现出了较缓慢的肿瘤生长速度，说明CAR-NK-92细胞在小鼠体内能够发挥较强的抗肿瘤作用。

NK细胞是一群先天毒性淋巴细胞，与T细胞相比具有较低的免疫原性。因此CAR NK被认为更有希望应用于肿瘤的临床治疗。当前CAR NK研究中较常使用的NK细胞有外周血源NK细胞、脐带血源NK细胞和NK细胞系。本研究选用NK-92细胞系作为研究对象，因为NK-92细胞在体外IL-2刺激下，能够大量扩增，并且在表型特征上不会发生较大的改变[9]；与此同时，NK-92细胞容易受慢病毒转染，可以得到高纯度的CAR-NK-92细胞[8]。因此，CAR-NK-92细胞在肿瘤治疗领域具有良好的应用前景。当前已经有很多国家正在积极开展CAR-NK-92研究，并且已经取得不错的治疗效果[10]。但是NK-92细胞来源特殊，在体内不能持续增殖，因而发挥的抗肿瘤作用有限[11]。为了解决CAR NK细胞在体内不能持续增殖的问题，Teng et al[12]研究发现在CAR序列中添加编码IL15序列可以显著提高PSCA-CAR-NK细胞在小鼠体内的存活时间，这项研究为CAR NK细胞在临床上的应用提供了新的研究思路。

在本研究中，MSLN-CAR-NK-92细胞表现出了较强的抗卵巢癌作用，可以为卵巢癌患者提供较好的治疗策略。但本实验仍然存在不足之处，包括对小鼠生存期周期的观察时间不足及缺少CAR-NK-92细胞在小鼠体内存活时间的研究。因此在后续的研究中，将进一步改进实验方案，真正建立卵巢癌患者临床可用的、安全有效的CAR NK细胞。