洗涤血小板制备及相关质量功能指标的研究

李晓华 李建民 鲍雪临 杨宁 郭敏 李玉秋 马媛媛 孙瑞玲 白兰兰

264003 烟台市中心血站1，山东烟台

050071 河北省血液中心2，河北石家庄

264003 烟台山医院3，山东烟台

随着血站行业新标准中“少血浆血小板、洗涤血小板等” 的确定以及贯彻实施，给血站行业提出了新的要求与挑战。因此，洗涤血小板制备及临床应用得到重视，本文在借鉴国内外洗涤血小板制备等经验的基础上加以改进，旨在摸索出以1个治疗量去白细胞混合浓缩血小板和1个治疗量去白细胞单采血小板为起始血液，用于制备洗涤血小板的工艺流程，现将两种起始血小板制备的66 例洗涤血小板的相关情况报告如下。

资料与方法

起始血小板来源：400 mL 全血白膜法制备的浓缩血小板，并以满足1个治疗量要求合并制备的去白细胞混合浓缩血小板36 例；单采去白细胞血小板30例；血小板外观检查色泽正常，无红染现象。

设备及试剂：KUBOTA-9942 离心机(生产厂家：日本久保田公司)，TSCD-Ⅱ无菌接驳机(生产厂家：日本泰尔茂公司)，MCS+血细胞单采机(生产厂家：美国血液技术公司)，ABL800FLEX 血气分析仪(生产厂家：雷度米特医疗设备有限公司)，ABL800 血气冲洗液、ABL800 定标液、XS-500i 全自动血液分析仪(生产厂家：烟台恒泰生物科技有限公司)，XS-500i试剂包、Photometer 4040 半自动生化分析仪(生产厂家：北京瑞尔达生物科技有限公司)，总蛋白测定试剂盒、分浆夹板(生产厂家：苏州医疗器械厂)，生理盐水(生产厂家：石家庄四药集团)。

洗涤血小板制备方法：将两类起始血小板通过无菌连接含2个空转移袋和1个含400 mL 生理盐水的三联袋为一体，整体平衡后以3 000 G，10 min，20～24℃，刹车为9 的离心条件置离心机进行离心(离心机的刹车设置固化程序中有0～9 档次选择，数字越大刹车时间越快，反之越慢)。离心完毕，取出起始血小板置分浆夹板，除袋底沉淀物外，将血浆全部转移至一空转移袋中，将100 mL 生理盐水缓慢加入沉淀袋中，静态冲洗1～2 次，清除袋中残存血浆，然后再将上清液转移至另一空转移袋中，注意避免沉淀物的流失。将余下的200 mL 生理盐水加入有沉淀物的袋中，分别做热合处理，视起始血小板的不同，含血浆的袋子可作为普通冰冻血浆(单采者，混合者因无标准可依，按报废处理)，含沉淀物的袋子即为制备的洗涤血小板。洗涤血小板置室温下自然解聚1 h，然后置20～24℃振荡箱中充分振荡解聚1～2 h。简易制备流程如图1 所示。洗涤前后的血小板分别留样进行检测。

图1 洗涤血小板简易制备流程图

血细胞计数方法：按全自动血液分析仪的要求完成红细胞、白细胞及血小板计数。血浆蛋白含量检测方法：按半自动生化分析仪要求完成血浆蛋白含量的测定。pH 及氧分压检测：按血气分析仪要求完成氧分压、二氧化碳(CO2)分压及pH 值测定。血小板聚集试验检测方法：采用经典比浊法(11.2 μmol/LADP 诱导)测定血小板最大聚集率。血小板黏附试验检测方法：采用经典玻球法测定血小板黏附率。

统计学方法：数据均用SPSS 17.0 统计学软件予以处理；计量资料以(±s)表示，比较采用t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

两种起始血液制备的洗涤血小板的质量指标检测情况：去白细胞单采血小板洗涤后血小板容量、血小板计数、白细胞残留量、红细胞混入量、血浆蛋白含量低于洗涤前，差异有统计学意义(P＜0.05)；去白细胞混合浓缩血小板洗涤后血小板容量、血小板计数、白细胞残留量、红细胞混入量、血浆蛋白含量低于洗涤前，差异有统计学意义(P＜0.05)。

两种起始血液制备的洗涤血小板功能指标检测情况：去白细胞单采血小板洗涤后血小板聚集试验、血小板黏附试验、血小板CO2分压低于洗涤前，差异有统计学意义(P＜0.05)；去白细胞混合浓缩血小板洗涤后血小板聚集试验、血小板黏附试验、血小板CO2分压低于洗涤前，差异有统计学意义(P＜0.05)。

讨 论

有关研究显示，血浆悬浮液血小板存在种种问题，包括对血浆过敏，IgA 缺乏等患者失去血小板治疗的机会，血浆中的大量补体、凝血酶、纤溶酶等物质影响血小板输注疗效，血浆中许多生物反应物质导致输血不良反应，血浆同种异体蛋白抗原导致同种免疫等问题；血小板储存期间释放的生长因子可能影响肿瘤患者的治疗，洗涤去除血浆中的生长因子对肿瘤患者的治疗很有必要；输注去白细胞血小板仍存在非溶血性发热的患者，采用生理盐水洗涤的血小板后，不良反应发生率从20%降到0.6%，据此认为储存的浓缩血小板悬浮液血浆中存在着引起非溶血性发热反应的物质，应该采用洗涤的方法去除；仅滤除浓缩血小板中的白细胞并不能完全避免输血发热反应；在血小板贮存期间，白细胞抗体、血小板抗体、细胞因子、补体成分、脂质成分等均可引起非溶血性发热反应[1-3]。血小板储存期间释放的生长因子可能影响肿瘤患者的治疗等，同时也指出了离心制备时的剪切力对血小板影响较大，会出现血小板数量减少、回收率下降、解聚困难、体外被激活、聚集力下降等情况；以及采用轻离心先行去除血小板中沉淀的红细胞再行洗涤，避免残存红细胞影响洗涤血小板质量等问题[4]。

表1 两种起始血液制备的洗涤血小板的质量指标检测情况

表2 两种起始血液制备的洗涤血小板功能指标检测情况

为提高洗涤效果和洗涤血小板的质量，本研究采取的方式：①对起始血小板进行外观检查，无红染者用于制备洗涤血小板，旨在规避红细胞混入量过高影响洗涤血小板质量，减少不必要的离心去红细胞操作过程；②采用一次离心去除全部血浆加2次静态沉淀物直接清洗法进行制备，旨在降低离心剪切力对血小板功能的影响，达到充分洗涤、简化流程、缩短制备时间以及后期及时应用等目的；③在选择起始血小板时有意识地选择血小板含量高者用于制备洗涤血小板，旨在规避洗涤过程受激活、上清液流失等因素导致的血小板含量降低，以满足临床治疗量的需求；④根据血站行业各自条件的不同，建立适合自身的洗涤血小板制备、质量保证等相关制度流程，基于满足临床治疗量和混合浓缩血小板制备特点而实施[5]。从试验结果来看，两种起始血小板制备的洗涤血小板，在容量、血小板计数、白细胞残留量、红细胞混入量、上清蛋白质含量、pH 值质量指标上均符合国家相关标准要求；在血小板聚集、血小板黏附、血小板氧分压、血小板CO2分压辅助指标的表现上，二者大体一致。

综上所述，在现有标准、技术等框架下，血站行业制备的洗涤血小板质量可靠，可向临床提供洗涤血小板，在适宜条件下可应用于临床治疗。