SD大鼠灌胃染毒蓖麻籽的毒代动力学研究及临床中毒样品初步检测

付佳婷，张 瑛，张文鹏，郭 磊，徐 斌，谢剑炜

（1.军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，抗毒药物与毒理学国家重点实验室，北京 100850；2.华北理工大学药学院，河北 唐山 063210；3.北京市公安司法鉴定中心，法庭毒物分析公安部重点实验室，北京 100192）

蓖麻（Ricinus communis）为大戟科蓖麻属下的唯一物种，是我国首要油料作物，在我国南北方广泛种植。蓖麻全株可入药，有祛湿通络、消肿、拔毒等功效；蓖麻种子（蓖麻籽）用于榨取富含甘油三酯的蓖麻油，因其具有黏度高、凝固点低、耐寒、耐高温等特点，是纺织、冶金、化工、机电等工业重要原料［1］。但蓖麻又属有毒植物，其毒性成分主要包括蓖麻毒素蛋白（ricin）、蓖麻凝集素蛋白和小分子化合物蓖麻碱（ricinine）等。蓖麻碱化学名为N-甲基-3-氰基-4-甲氧基-吡喃酮，分子式为C8H8N2O2，相对分子质量为164.17，属剧毒生物碱，主要存在于蓖麻的茎叶和籽实中。小鼠sc给予蓖麻碱的LD50为25 mg·kg-1。过量服食可引起呕吐、呼吸抑制和肾损害等［2-3］。

鉴于全球范围内蓖麻毒素恐怖活动和蓖麻相关中毒事件时有发生，针对蓖麻毒素蛋白的分析检测方法已有诸多报道。但蓖麻毒素蛋白具有体内易降解、检测时间窗窄（＜8 h）、方法技术需求高和检测周期长等问题［4-6］，现有方法仍无法满足临床中毒诊断的需求。蓖麻碱与蓖麻毒素蛋白同时存在于蓖麻籽中，误服蓖麻籽后体内蓖麻碱暴露量相对较高，其检测方法简便、灵敏，适于生物医学样品的检测［7-10］，目前已用于蓖麻籽接触或中毒者生物样品的检测。本研究建立一种血浆中蓖麻碱的液相色谱-三重四极杆串联质谱（liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry，LC-QqQ MS/MS）定量分析方法，检测ig染毒后蓖麻碱在SD大鼠体内的毒代动力学参数，并尝试将该法用于临床中毒者血浆和尿液样本的半定量检测。

1 材料与方法

1.1 试剂和主要仪器

蓖麻碱参考品（货号R495550，批号2-KAS-3，纯度大于98%），加拿大TCI公司；氢溴酸东莨菪碱对照品（货号：100476，批号：100476-180301），中国食品药品检定研究院，14个不同产地蓖麻籽分别购于河北、山西、四川等药材市场；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）和甲酸（质谱级），均美国Fisher公司。

SPF级健康雄性SD大鼠，15只，体重180～220 g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供（动物合格证号1103241911031288）。实验前，大鼠饲养于室温23.5～24.5℃、相对湿度为45%～55%的条件下，明暗各12 h（8∶00～20∶00灯光照明），饲料为啮齿类普通维持饲料，自由饮食饮水。所有动物实验遵循军事医学研究院动物实验伦理委员会规定。

1200型液相色谱仪和6430型LC-QqQMS/MS系统，配备电喷雾电离源，液相泵、自动进样器和在线脱气装置，美国安捷伦公司；Synergi Polar-PR 100Å色谱柱（100 mm×2 mm，2.5 μm），美国飞诺美公司；涡旋振荡器（Vortex-Genie2），美国Scientific Industries公司；十万分之一电子分析天平（PL203），美国梅特勒-托利多公司；台式高速冷冻离心机（3K30），美国Sigma公司；低温组织破碎仪（SPEX6775），美国SPEX公司；多功能静音型超声波清洗机（LMDTC-10F），中国绿绵科技有限公司；真空离心浓缩仪（RCD33），德国Christ公司；超纯水（18 MΩ·cm）由Milli-QA10超纯水仪制备，美国Millipore公司。

1.2 标准溶液和工作溶液的配制

精密称取蓖麻碱和氢溴酸东莨菪碱各2.0和2.5 mg，以50%甲醇水溶液配制得到浓度为0.2 g·L-1母液（氢溴酸东莨菪碱按东莨菪碱计）；取蓖麻碱母液，以50%甲醇水溶液逐级稀释至5000，3750，1000，250，50，10，2，1和0.5 μg·L-1，作为系列标准溶液；取东莨菪碱母液，以50%甲醇水溶液逐级稀释至500 μg·L-1作为内标溶液。

取40 μL正常大鼠血浆，分别加入10 μL蓖麻碱标准溶液和2.5 μL东莨菪碱内标溶液，制备成为蓖麻碱血浆浓度为1000，750，200，50，10，2和1 μg·L-1的工作曲线样品。所有溶液4℃储存备用。

1.3 色谱和质谱条件

色谱条件：Synergi Polar-PR 100Å色谱柱（100 mm×2 mm，2.5 μm），柱温40℃，进样体积5 μL。流动相A为含0.1%甲酸水溶液，B为乙腈。梯度洗脱程序为：0～1 min，15%B；1～5 min，15%～90%B；5.1～7 min，15%B。流速为0.3 mL·min-1。

质谱条件：ESI源，正离子方式检测，源温350℃，喷雾电压4 kV，喷雾气压力40 psi，氮气流速10 L·min-1；扫描方式：多反应监测（MRM）；用于分析的离子对分别为：蓖麻碱定量离子对质荷比（m/z）165→138（碎裂电压130 V，毛细管电压17 V），定性离子对为m/z165→82（碎裂电压130 V，毛细管电压29 V）；东莨菪碱（内标）定量离子对为m/z304→156（碎裂电压110 V，毛细管电压13 V）。

1.4 测定不同产地蓖麻籽中蓖麻碱含量

分别选取14个不同产地蓖麻籽并标号，将种子均匀铺成3层，每一层随机取5颗共15颗，进行去壳、称量，加入研磨钢珠后用低温组织破碎仪进行研磨，后加入种子质量5倍的超纯水，充分涡旋，超声振荡10 min，14 000×g离心10 min，取上清液1 mL置于进样瓶中用于LC-MS/MS定量检测。

1.5 动物、染毒和血浆样品处理

结合已报道蓖麻籽的LD50数据［3］，确定大鼠ig给予蓖麻籽匀浆液的染毒剂量（折算成蓖麻碱量）分别为0.3，1.0和3.0 mg·kg-1，即大鼠体重按200 g计，每粒蓖麻籽平均重量0.2 g，则染毒剂量相当于每只大鼠ig 1/3，1和3粒蓖麻籽。

使用新鲜T11号蓖麻籽，超纯水匀浆后以超纯水稀释至相当于蓖麻碱含量0.6，0.2和0.06 kg·L-1，待染毒使用。每剂量组5只大鼠，每只大鼠ig体积为1.0 mL。分别于ig前后0.25，0.5，1，2，4，6，8，12和24 h时进行眼眶后静脉丛采血，肝素钠抗凝，经1000×g离心10 min后取上清得到血浆样品。

取血浆样品50 μL加入2.5 μL东莨菪碱内标溶液500 μg·L-1，涡旋1 min；加入甲醇∶乙腈（3/1，V/V）混合溶液200 μL沉淀蛋白，涡旋1 min，14 000×g离心10 min；取上清液，50℃真空离心浓缩2 h；待溶液旋干后加入15%乙腈水溶液50 μL，涡旋1 min，14 000×g离心10 min，上清液转移至进样瓶中待测。

使用Phoenix WinNonlin软件（版本号8.2），分别对0.3，1.0和3.0 g·kg-1组大鼠不同时间点血浆中蓖麻碱的血药浓度进行非房室模型拟合［11］，并绘制血浆浓度-时间曲线图，计算血浆毒动学参数。

1.6 血浆样品分析方法学验证

1.6.1 工作曲线和定量下限

以蓖麻碱浓度为横坐标（X），蓖麻碱与内标峰面积比值为纵坐标（Y），以加权（1/X2）最小二乘法进行线性回归，即得工作曲线，其定量下限为工作曲线上最低浓度点。

1.6.2 批内、批间精密度和准确度

取同一批母液加入SD大鼠空白血浆中，配制800（高），75（中）和2.5（低）和1 μg·L-1（定量下限）4个浓度的质控样品，每个浓度平行制备6个样本，根据随行测定的工作曲线计算质控样品的实际浓度。该法的测量值与分析物标示浓度的接近程度为批内准确度，以相对误差（RE，%）表示；而6个测量值之间的相对标准差（RSD，%）即为批内精密度；连续3 d进行相同操作，测得批间精密度和准确度。

1.6.3 回收率和基质效应

为考察大鼠血浆中复杂基质对检测结果的影响，参照1.5处理6个来自不同个体的大鼠空白血浆，复溶时，加入适量母液，用15%乙腈水溶液稀释为浓度800和2.5 μg·L-1的含基质样本，同时用15%乙腈水溶液稀释母液为浓度800和2.5 μg·L-1的溶液样本，通过计算内标归一化的基质因子的变异系数考察基质效应，以变异系数≤15%为符合基质效应的要求。同时，在800和2.5 μg·L-1浓度2个水平下比较血浆样本与溶液样本的峰面积考察回收率。

1.6.4 残留效应

取处理后的高浓度蓖麻碱质控样品（750 μg·L-1）和空白血浆样本交替进样分析5次，考察标准曲线高浓度点进样后有无残留。

1.7 临床中毒样品检测

临床中毒样品来自北京市某医院急诊科。2020年10月收治1例中青年男性患者，无其他躯体疾病，因误信蓖麻具有保健功效，口服3～4粒蓖麻籽4 h后出现恶心、呕吐等症状。采集中毒后4和14 h血液样品2份和14 h尿液样品1份。

血浆样品参照1.5处理，尿液样品用1倍体积甲醇溶液稀释后14 000×g离心10 min，上清液转移至进样瓶中进行半定量分析。同时，分别配制浓度均为100 μg·L-1蓖麻碱的人空白血浆加标样品和尿液加标样品，同样处理后检测，采用单点外标法进行半定量测定。

2 结果

2.1 蓖麻籽中蓖麻碱的含量

6个产地14份蓖麻籽中的蓖麻碱含量测定结果见（表1）。其中以编号9的新疆产蓖麻籽中蓖麻碱含量最高，为1.60 g·kg-1；内蒙古通辽产蓖麻籽（T19）中蓖麻碱含量最低，为0.95 g·kg-1。14份蓖麻籽中蓖麻碱含量均值为（1.19±0.22）g·kg-1（百分含量约为0.12%），与文献报道基本一致［12］。选取含量较接近中位值的内蒙T11号蓖麻籽ig给予大鼠进行毒动学研究。

Tab.1 Content of ricinine in castor beans from different origins

2.2 SD大鼠血浆中蓖麻碱浓度定量检测方法学验证

0.1%甲酸水溶液和乙腈作为流动相时，可在5 min梯度下使待测物蓖麻碱和内标东莨菪碱较好分离；同时色谱柱选用反相醚联苯基固定相，可有效改善传统C18色谱柱在分析生物碱类化合物时的色谱峰拖尾现象［13-14］，蓖麻碱和东莨菪碱的保留时间分别为2.67和2.85 min（图1）。

Fig.1 Extracted ion chromatograms of different ricinine samples.A：matrix blank；B and C：plasma samples spiked with ricinine at 1.0（B）and 1000 μg·L-1（C）；D：a plasma sample from rats after ig administration of caster bean homogenate.

大鼠血浆中蓖麻碱在1～1000 μg·L-1范围内线性关系良好，线性回归方程为y=0.0082x+0.0253（R2=0.9644），最低定量限为1.0 μg·L-1（S/N＞10），最低检出限为0.5 μg·L-1（S/N≥5），其血浆样品的批内和批间精密度均≤15%，批内和批间准确度在88.1%～100.8%，基质效应为 4.8%～8.9%（RSD≤1.9%），方法回收率在77%～81%（RSD≤13%），且在高浓度质控样品（750 μg·L-1）进样后无残留，均能满足生物样品分析的要求（表2）。

Tab.2 Precision and accurcy of the LC-MS/MS method for ricinine determination in rat plasma

Fig.2 Plasma concentration-time curve of ricinine after ig administration of castor bean homogenate in SD rats determined by LC-MS/MS.The dose of caster bean homogenate（equivalent content of ricinine）was 0.3，1.0 and 3.0 g·kg-1，separately.±s，n=5.

2.3 蓖麻籽染毒大鼠血浆中蓖麻碱毒动学参数

经蓖麻籽匀浆液ig染毒，SD大鼠血浆蓖麻碱的平均血浆浓度-时间曲线见图3。0.3 mg·kg-1染毒组样品的蓖麻碱检出时间窗为12 h，而1.0和3.0 mg·kg-1组24 h样品中仍可检测到高于定量限的蓖麻碱。毒动学参数见表4，结果表明，3个染毒剂量组均呈现单峰，且达峰浓度（Cmax）和曲线下面积（AUC）均随剂量增加而增加；染毒后0.7～0.8 h达到最大血浆暴露浓度，之后快速下降，消除半衰期（T1/2）为2.2～2.5 h。0.3和1.0 mg·kg-1组平均驻留时间非常接近，为4.1和4.5 h，而3.0 mg·kg-1组平均驻留时间较长，为8.2 h。

Tab.4 Toxicokinetic parameters of ricinine in rat plasma determined by LS-MS/MS method

2.4 临床中毒样品检测结果分析

结果显示，临床中毒后4和14 h血浆样品中蓖麻碱的浓度分别为25.5和22.2 μg·L-1，中毒后14 h尿样中蓖麻碱的浓度为92.2 μg·L-1。

3 讨论

本研究建立了以东莨菪碱为内标的SD大鼠血浆中蓖麻碱的LC-MS/MS定量分析方法，该法操作简便，具有较高专属性和灵敏度，可满足本实验低浓度分析物测定的需要。采用蓖麻籽匀浆液ig给予大鼠，进行了蓖麻碱毒代动力学研究，其体内有效暴露量和中毒剂量呈正相关，检测时间窗宽，适于生物医学样品检测，但其在体内消除也较快。值得注意的是，3.0 mg·kg-1染毒组的平均驻留时间约是其他组的2倍，同时在24 h出现了一个明显的上升趋势，推测中毒蓖麻碱在体内可能存在二次释放效应，但需要进一步研究。

本研究也对临床中毒样本进行了检测，结合已报道的临床中毒数据来看，蓖麻中毒途径包括口服、注射等，检材涵盖血液、尿液、呕吐液以及尸检的组织样本，其中蓖麻碱的检出量范围差别较大，从μg·L-1到mg·L-1浓度水平；检出时间窗从中毒后4到38 h不等；与个体差异、中毒方式与蓖麻中蓖麻碱含量不同等密切相关。如2019年比利时1名26岁男性静脉注射蓖麻籽粗提物自杀［8］，送医后医治无效死亡，其6 h血样和7 h尿样中的蓖麻碱浓度分别为16.5和79.6 μg·L-1。美国疾病控制预防中心也曾报道1例口服6粒蓖麻籽自杀未遂事例［15］，该患者为58岁美国男性，将蓖麻籽咀嚼吞咽，其14 h尿样中检出了高达1400 μg·L-1的蓖麻碱。

综上，本研究建立了蓖麻碱LC-MS/MS定量方法并应用于SD大鼠血浆中蓖麻碱的快速、灵敏、准确测定及毒代动力学曲线绘制。毒代动力学研究结果阐明了蓖麻碱体内代谢行为、中毒检测时间窗和体内驻留时间等。对临床中毒血、尿样本的初步研究结果表明，蓖麻碱可作为蓖麻籽中毒诊断的标志物，且可在此工作基础上建立基于人血浆和尿液基质样品的准确定量方法，为蓖麻中毒的临床诊断确证和预后评估提供重要数据。