红景天苷负向调控TACC2表达抑制NSCLC细胞增殖及上皮间充质转化

何邵波，罗甫花，蒋传命，刘选梅

(1.邵阳学院 医学检验学院， 湖南 邵阳 422000; 2.邵阳学院附属第一医院， 湖南 邵阳 422000)

肺癌是全球癌死亡的主要原因之一，其发病率和病死率正呈逐年上升趋势。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌的主要亚群，占肺癌发生的85%～90%[1]。大量临床研究表明[2]，肺肿瘤患者的发病率以及病死率与肿瘤细胞的增殖以及迁移能力高度相关，有效抑制肿瘤细胞的增殖、迁移过程是控制NSCLC发生发展的重要方式。红景天苷(salidroside, SAL)是红景天属植物的活性成分，不仅能够发挥抗氧化、调节物质代谢、增强免疫的功能，还具有显著的抗肿瘤作用[3]。研究表明，SAL可通过抑制多种人类恶性肿瘤细胞的增殖，并诱导肿瘤细胞凋亡来发挥抗肿瘤作用[4]。目前SAL已广泛用于膀胱癌、乳腺癌等肿瘤的研究，但对肺癌细胞的作用及相关机制尚无报道。

转化酸性卷曲螺旋蛋白(transforming acidic coiled-coil protein, TACC)是中心体的组成蛋白，可通过在有丝分裂过程中参与纺锤体的形成，稳定微管蛋白结构来调节染色体的功能[5]。细胞内TACC蛋白水平变化与多种肿瘤的发生密切相关。与正常组织相比，TACC2在乳腺癌组织中表达显著上调[6]。此外，抑制胃癌细胞中TACC2的表达能够有效降低肿瘤细胞的增殖能力[7]。尽管目前已经明确了TACC2在部分肿瘤细胞中的作用，但其在肺癌中的表达及对肺癌细胞增殖、迁移的影响尚不清楚。本研究拟通过检测SAL对肺癌细胞系A549和H1299增殖、凋亡以及上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)的影响，并明确TACC2在其中的作用机制，以期为治疗、控制NSCLC的发生提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

人肺癌细胞系A549、H358、H1299、H1650以及人胚肺成纤维细胞系HFL-1(中科院上海细胞库)；红景天苷(SAL)(南京格尔狄生物科技有限公司)；pcDNA3.0-TACC2质粒载体(上海生工生物工程有限公司构建)；CCK-8试剂(北京索莱宝科技有限公司)；Trizol试剂盒、细胞转染试剂盒(Invitrogen公司)；Annexin V-FITC凋亡试剂盒(ThermoFisher Scientific公司)；兔抗p-p38、t-p38、β-actin一抗(CST公司)；兔抗TACC2、E-cadherin、N-cadherin一抗(Abcam公司)；NF-κb抑制剂BAY11-7082、p38激动剂anisomycin(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 肺癌组织以及正常组织样本的收集：收集2019年1月至2020年4月于邵阳学院附属第一人民医院行根治手术肺癌患者的癌组织样本22例，同时取癌旁组织(距离癌组织约2 cm)以及正常肺组织(距离癌组织大于6 cm)。患者肺癌组织样本均经病理检测确诊为肺癌，且手术前未接受其他抗肿瘤治疗，所有患者均签署知情同意书。所有组织样本切除后立即提取组织RNA或者于液氮中保存待用。

1.2.2 细胞的分组与处理：将NSCLC细胞系以及HFL-1细胞放置37℃水浴箱中进行复苏，随后移至细胞培养瓶内。在细胞培养瓶中加入完全的DMEM培养基(含10%胎牛血清)，用吹打管吹打混匀后，放置于37 ℃、5%培养箱中培养，观察细胞的贴壁情况。待细胞长势良好进行如下处理：1)用浓度为0、20、40以及60 μmol/L的SAL处理细胞24 h，收集细胞待用；2)分别用100 μL不含血清的DMEM培养基对pcDNA3.0-TACC2和Lipofectamine 2000进行稀释，并将pcDNA3.0-TACC2质粒转染细胞，再用60 μmol/L SAL处理细胞24 h，收集细胞待用；3)10 μmol/L p38激动剂anisomycin预处理细胞12 h后，再用60 μmol/L SAL处理细胞24 h并收集细胞待用。

1.2.3 RT-qPCR检测TACC2、E-cadherin以及N-cadherin mRNA：将经上述处理的细胞收集至离心管内，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，弃去上清，留取沉淀。在沉淀中加入Trizol，按照RNA提取试剂盒内的说明书提取细胞内的总RNA，并配制反转录反应体系，将RNA反转录合成cDNA。合成的cDNA按照预变性、变性、退火、延伸的程序扩增40个循环，每个样本设置3个复孔，扩增完毕后，使用2-△Ct法计算TACC2、E-cadherin以及N-cadherin的相对表达量。引物设计如下：TACC2上游引物：5′-CTGCTGTTCCTCCAGTTCCA-3′，下游引物：5′-GGA ACTCTGAGGTCAACTTGCT-3′；E-cadherin上游引物：5′-CAGGTCTCCTCATGGCTTTGC-3′，下游引物：5′-CTTCCGAAAAGAAGGCTGTCC-3′；N-cadherin上游引物： 5′-TGAAGTCCCCAATGTCTCCA-3′，下游引物：5′-GCATCATCATCCTGCTTATCC-3′；GAPDH上游引物： 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。

1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖：用胰蛋白酶消化处于对数期的A549和H1299细胞，将细胞悬液以0.5×105个/mL浓度接种至96孔板中，置于37 ℃、5%培养箱中继续培养。待细胞贴壁后，按照上述操作处理细胞，每个实验组设置3个副孔。24 h后，在各细胞孔中加入10 μL的CCK-8溶液，继续培养4 h。使用酶标仪在490 nm处检测各细胞孔的A值，并计算细胞增殖水平。

1.2.5 Western blot检测细胞蛋白表达：收集经过上述处理的A549和H1299细胞，使用PBS冲洗细胞:3次，加入适量细胞裂解液后，细胞刮刮取细胞至离心管中。超声裂解10 min后，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，吸取上清，即为获得的细胞总蛋白，使用BCA 法测蛋白浓度。蛋白样品进行SDS-PAGE，并转至PVDF膜上。10%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入相应的一抗4 ℃孵育过夜。TBST洗涤5次后，二抗室温孵育1 h。最后进行ECL显影，并通过Image J2X软件进行吸光度值扫描，并计算各蛋白的相对表达量。

1.2.6 流式细胞测量术检测细胞凋亡：收集经过上述处理的A549和H1299细胞。经胰蛋白酶消化后，1 000 r/min离心8 min，弃培养基后PBS漂洗3次，再次离心弃上清并用缓冲液重悬沉淀。加入10 μL Annexin-V-FITC和10 μL PI轻轻混匀后避光孵育15 min，并加入50 μg/mL碘化丙啶进行染色。染色完成后于流式细胞仪检测各细胞凋亡情况。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 TACC2 mRNA在肺癌组织与NSCLC细胞中的表达

TACC2在肺癌组织中的相对表达量要显著高于癌旁组织以及正常的肺组织(P<0.01)(图1A)。肺癌A549、H358、H1299以及H1650细胞中TACC2的相对表达水平显著高于HFL-1细胞(P<0.05)(图1B)。

A.expression level of TACC2 in tumor tissues(n=22)； *P<0.05 compared with adjacent tissues and normal tissues；B.expression level of TACC2 in lung cancer cell lines(n=3); *P<0.05 compared with HFL-1 cell group

2.2 SAL抑制肺癌细胞增殖及EMT并诱导细胞凋亡

浓度为0、20、40以及60 μmol/L的SAL处理细胞24 h后，A549以及H1299细胞的增殖水平明显受抑制，且呈一定的浓度依赖性(图2A)。此外，A549以及H1299细胞的凋亡水平也随SAL刺激浓度增加而显著上升(P<0.05)(图2B)。不同SAL处理后，A549以及H1299细胞中EMT相关分子E-cadherin表达上调，N-cadherin表达下调，提示细胞EMT水平受抑制(图2C)。

A.effect of SAL on proliferation of lung cancer cells；B.effect of SAL on apoptosis of lung cancer cells；C.effect of SAL on EMT of lung cancer cells; *P<0.05 compared with 0 μmol/L SAL group

2.3 SAL经NF-κB通路下调NSCLC细胞中TACC2表达

采用20、40以及60 μmol/L SAL处理后，细胞内TACC2蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)(图3A)。不同浓度SAL处理后，A549及H1299细胞内TACC2 mRNA水平同样显著低于对照组(P<0.05)(图3B)。此外，经60 μmol/L SAL处理后，A549及H1299细胞内IκBα磷酸化水平显著升高(图3C)，而经NF-κB抑制剂BAY11-7082预处理后，细胞内TACC2表达显著高于对照组(图3C)。

A.effect of SAL on the expression of TACC2 protein in lung cancer cells；B.effect of SAL on the expression of TACC2 mRNA in lung cancer cells SAL；C.SAL down-regulates TACC2 expression in lung cancer cells via NF-κ B pathway; *P<0.05 compared with 0 μmol/L SAL group; #P<0.05 compared with BAY11-7082 untreated group

2.4 过表达TACC2对细胞增殖、凋亡的影响

过表达TACC2后，A549以及H1299细胞增殖水平显著上升，要高于对照组(P<0.05)(图4A)。此外，转染pcDNA3.0-TACC2质粒同样能够显著降低A549以及H1299细胞的凋亡水平(P<0.05)(图4B)。

A.effects of TACC2 over-expression on proliferation of lung cancer cells；B.effects of TACC2 over-expression on apoptosis of lung cancer cells; *P<0.05 compared with 0 μmol/L SAL group; #P<0.05 compared with untransfected group

2.5 过表达TACC2对NSCLC细胞EMT的影响

过表达TACC2后，A549以及H1299细胞内E-cadherin蛋白表达下降，N-cadherin蛋白表达上升(图5A)。转染pcDNA3.0-TACC2质粒后细胞内E-cadherin mRNA表达显著低于未转染对照组，而N-cadherin mRNA表达显著高于未转染对照组(图5B)。

A.effects of TACC2 over-expression on the expression of EMT protein in lung cancer cells；B.effects of TACC2 over-expression on the expression of EMT mRNA in lung cancer cells; *P<0.05 compared with 0 μmol/L SAL group; #P<0.05 compared with untransfected group

2.6 SAL经TACC2抑制p38/MAPK通路

不同浓度SAL处理A549细胞和H1299细胞后，细胞内p38/MAPK的磷酸化水平均显著降低(图6A)。此外，转染pcDNA3.0-TACC2质粒过表达TACC2后，细胞内p38/MAPK的磷酸化水平较未转染的对照组显著上升(图6B)。

A.SAL inhibited the phosphorylation of p38/MAPK in lung cancer cells；B.effects of TACC2 over-expression on the phosphorylation of p38/MAPK in lung cancer cells; *P<0.05 compared with 0 μmol/L SAL group; #P<0.05 compared with untransfected group

2.7 SAL抑制p38/MAPK通路抑制细胞增殖以及EMT

加入p38激动剂anisomycin后，A549以及H1299细胞增殖水平要显著高于未经anisomycin预处理的对照组(图7A)，且E-cadherin蛋白表达显著下降，而N-cadherin蛋白表达显著上升(图7B)。此外，anisomycin处理后，细胞内E-cadherin、N-cadherin mRNA的表达水平也与Western blot结果一致(图7C)。

A.role of P38/MAPK pathway in SAL inhibited the proliferation of cell；B.expression levels of E-cadherin and N-cadherin proteins were detected after inhibition of p38/MAPK pathway；Cexpression levels of E-cadherin and N-cadherin mRNA were detected after inhibition of p38/MAPK pathway; *P<0.05 compared with 0 μmol/L SAL group; #P<0.05 compared with anisomycin untreated group

3 讨论

本研究通过检测SAL对A549以及H1299细胞增殖、凋亡以及EMT水平的影响，证实SAL对NSCLC细胞同样具有抑制细胞增殖以及EMT，并诱导细胞凋亡的作用。考虑到SAL在其他肿瘤中的重要作用，本结果也与之前SAL的研究相符[8-9]。

近年来，大量研究表明在不同肿瘤组织中均存在TACC2的高表达，且与患者的病程发展以及预后不良有关[10-11]。本研究中通过检测发现TAAC2在肺癌组织以及肺癌细胞系中也均为高表达，说明TAAC2同样可作为反映肺癌患者疾病发展以及预后的指标。肿瘤细胞转移、扩散至其他组织器官主要涉及细胞的增殖、凋亡，同时与细胞的EMT过程也密切关系。

有研究表明[12-13]，原发性肝癌细胞TACC蛋白高表达时，可上调EMT相关蛋白水平进而激活下游相关信号通路，从而促进肿瘤细胞的 EMT过程。本研究结果显示，SAL可显著降低NSCLC细胞内TACC2水平，而在A549以及H1299细胞内过表达TAAC2后，SAL对A549及H1299细胞增殖、EMT水平的抑制作用显著降低。考虑到TACC2在肿瘤细胞增殖过程中的重要作用[10]，SAL在调节NSCLC细胞增殖、EMT过程时，可能通过抑制TACC2表达影响细胞周期调节因子，使NSCLC细胞处于G1阻滞期，进而导致肿瘤细胞增殖异常。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一种重要丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，它能够将细胞因子、神经递质等刺激信号从细胞表面传导到细胞核内进而促进细胞应激反应[14]。本研究采用不同浓度SAL处理均可显著抑制细胞内p38/MAPK的磷酸化水平。表明SAL通过调节TACC2表达抑制NSCLC细胞的增殖以及EMT过程可能与p38/MAPK通路的抑制有关。然而，p38激动剂虽然能部分减弱SAL对NSCLC细胞增殖及EMT的抑制作用，但并不能完全消除SAL的抑制作用。因此，其中是否还存在其他重要的调控机制，仍需进一步探究。

综上所述，本研究发现TACC2在肺癌组织及肺癌细胞系中均呈高表达状态，并初步证实SAL可通过下调TACC2表达来抑制A549以及H1299细胞的增殖、EMT水平，该过程可能与p38/MAPK信号通路的抑制有关。本研究为进一步明确NSCLC的发生机制以及开发肺癌相关治疗药物提供了新的思路。