乔松素抑制人胃癌细胞系AGS增殖、迁移和侵袭

李 洵，付晓霞，樊丽伟，汪景坤，张东姣，赵炎焕，张 磊，赵玉红

(中国人民解放军陆军第八十二集团军医院 消化内科, 河北 保定 071000)

胃癌(gastric cancer)是全球最常见的恶性肿瘤。中药有效成分在肿瘤辅助治疗中具有明显的治疗效果，有较好疗效[1-2]。开发新的治疗胃癌的有效中药成分是防治胃癌的重要途径。乔松素(pinocembrin)是一种黄酮化合物，且抗炎、抗肿瘤等作用明显[3-4]。乔松素通过下调N-cadherin和GABAB受体的mRNA水平来抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移并促进其凋亡[5]。乔松素可以诱导内质网应激介导的细胞凋亡并抑制黑色素瘤的自噬[6]。说明乔松素具有抗癌作用，但其对胃癌的影响及作用机制尚不清楚。研究表明miR-34a-5p高表达促进胃腺癌细胞凋亡[7]。KLF5和MYC调节的LINC00346通过调控miR-34a-5p促进胃癌的进展并显示不良预后[8]。然而乔松素影响胃癌进展的作用是否涉及miR-34a-5p仍然未知。因此，本研究重点考察乔松素是否通过miR-34a-5p影响胃癌细胞的发展。

1 材料与方法

1.1 主要材料

RPMI-1640培养基(Gibco公司)；人胃癌细胞系AGS(ATCC公司)； 乔松素(纯度: HPLC≥98%，上海联祖生物科技有限公司)；CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所)；实时荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa公司)；蛋白提取试剂盒(Invent公司)；MMP2、MMP9、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT多克隆抗体(巴傲得生物科技有限公司)；山羊抗兔IgG-HRP(AAT Bioquest公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组: 将AGS细胞常规培养于RPMI-1640培养基中，分别用50、100、200、400 μmol/L的乔松素处理AGS细胞，不作任何处理的细胞作为NC组(normal control)；将miR-34a-5p抑制剂及阴性对照转染至AGS细胞后用200 μmol/L的乔松素处理，记为200 μmol/L pinocembrin +anti-miR-NC组、200 μmol/L pinocembrin +anti-miR-34a-5p组。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖活性：分别收集1.2.1中各组AGS细胞接种至96孔板， 2×103个/孔，并保持48 h。之后与的CCK-8溶液10 μL反应，吸光度(A)值在450 nm处酶标仪读取。

1.2.3 流式细胞测量术检测细胞周期：各组AGS细胞用预冷PBS洗细胞两次，加入预冷70%乙醇，于4 ℃固定过夜，4 ℃避光环境中加入500 μL PBS(含50 μg/mL PI、100 μg/mL RNase A、0.2% Triton X-100)，并保持30 min。上流式细胞仪检测分析各周期变化。

1.2.4 Transwell小室法检测细胞迁移、侵袭和迁移：分别收集各组AGS细胞，于无血清的培养液中饥饿培养12 h，吸去培养液，调整细胞浓度为5×105个/mL。在小室中添加100 μL细胞悬液，下室加入500 μL含血清培养液。培养箱内孵育24 h后弃去培养液，用PBS冲洗细胞，加甲醇固定30 min，结晶紫染色，20 min后PBS清洗。侵袭：Matrigel包被小室底部膜的上室，按迁移实验操作。迁移和侵袭的细胞数均在显微镜下统计。

1.2.5 蛋白质免疫印迹实验检测细胞蛋白质表达：分别收集各组AGS细胞，利用蛋白质提取试剂盒提取细胞总蛋白质后进行电泳并转膜。膜封闭1 h后依次加入一抗(1∶1 000，4 ℃)、二抗(1∶2 000，室温)分别孵育12 h、2 h。用ECL显影，以目的条带/内参β-actin条带的吸光度值之比来分析蛋白质相对表达水平。其中一抗为MMP2、MMP9、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT、β-actin。

1.2.6 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测AGS细胞miR-34a-5p表达:Tizol法提取各组AGS细胞总RNA，并进行反转录，将反转录产物(模板)在95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环的条件下进行PCR扩增；根据2-△△Ct法计算miR-34a-5p表达水平。其中miR-34a-5p上游引物5′-TGGCAGTGTCTT AGCTGGTTGT-3′，下游引物5′-GCGAGCACAGAATT AATACGAC-3′；U6上游引物5′-GCTTCGGCAGCA CATATACTAA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAA TTTGCGT-3′。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 乔松素抑制AGS细胞增殖

与NC组比较，乔松素各浓度组AGS细胞增殖活性和S期细胞比例降低，G0/G1期细胞比例升高(P<0.05)(图1，表1)。

表1 不同浓度乔松素对AGS细胞增殖活性及周期的影响

图1 不同浓度乔松素对AGS细胞周期的影响

2.2 乔松素对AGS细胞迁移和侵袭的抑制作用

不同浓度乔松素处理后AGS细胞后，MMP2、MMP9蛋白的表达水平低于NC组，细胞迁移和侵袭数量低于NC组(P<0.05)(图2，表2)。

表2 乔松素对AGS细胞迁移和侵袭的抑制作用

A.Transwell chamber assay detected cell migration and invasion(×200)；B.Western blot detected the inhibitory effect of pinocembrin on MMP2 and MMP9 protein expression in AGS cells

2.3 乔松素对miR-34a-5p表达的影响

不同浓度乔松素处理后AGS细胞后，与NC组比较，miR-34a-5p的表达水平均显著升高(P<0.05)(表3)。

表3 乔松素对miR-34a-5p表达的影响

2.4 anti-miR-34a-5p可以减轻乔松素对AGS细胞增殖，迁移和侵袭的影响

与200 μmol/L pinocembrin +anti-miR-NC组比较，200 μmol/L pinocembrin +anti-miR-34a-5p组AGS细胞中miR-34a-5p的表达水平、G0/G1期细胞比例降低，MMP2、MMP9蛋白表达水平、细胞增殖活性、迁移和侵袭细胞数量以及S期细胞比例升高(P<0.05)(图3，表4)。

表4 Anti-miR-34a-5p可以减轻乔松素对胃癌细胞AGS增殖、迁移和侵袭以及相关蛋白表达的影响

A.flow cytometry to detect cell cycle; B.Transwell chamber assay detected cell migration and invasion(×200); C.Western blot determined the roles of pinocembrin and anti-miR-34a-5p on MMP2 and MMP9 protein expression in AGS cells

2.5 PI3K/AKT信号通路蛋白表达情况

与NC组比较，200 μmol/L pinocembrin组p-PI3K、p-AKT蛋白的表达水平降低(P<0.05)；与200 μmol/L pinocembrin+anti-miR-NC组比较，200 μmol/L pinocembrin+anti-miR-34a-5p组p-PI3K、p-AKT蛋白的表达水平升高(P<0.05)(图4，表5)。

表5 PI3K/AKT信号通路蛋白表达情况

图4 Western blot检测PI3K/AKT信号通路蛋白表达

3 讨论

研究表明，黄酮类化合物具有抗肿瘤作用，如从墨脱大苞鞘花分离出的黄酮类化合物乔松素可通过失活MAPK途径来诱导HepG2细胞的细胞周期停滞并触发凋亡[9]；还诱导了大肠癌细胞系HCT 116的凋亡[10]。乔松素可抑制TGF-β1诱导的视网膜母细胞瘤细胞Y-79的上皮-间质转化和转移[11]。以上研究均提示乔松素在多种恶性肿瘤发挥抗癌作用。为研究其对胃癌的作用，本实验采用不同浓度的乔松素对AGS细胞进行处理，结果显示，经不同浓度的乔松素处理后，AGS细胞的增殖活性、S期细胞比例、MMP2、MMP9蛋白表达水平以及迁移和侵袭细胞数量均降低，G0/G1期细胞比例升高，提示乔松素抑制了胃癌AGS细胞的增殖、迁移和侵袭。

研究报道miR-34a-5p在胃癌中下调表达[12]。且研究表明miR-34a-5p高表达促进胃腺癌细胞凋亡[7]。以上研究表明miR-34a-5p参与胃癌的进展过程，且可能起抑癌作用。本实验结果显示，不同浓度的乔松素处理的胃癌细胞系AGS中miR-34a-5p的表达水平升高；乔松素抑制AGS细胞增殖、迁移和侵袭的效果在anti-miR-34a-5p处理得以改善。因此，上调miR-34a-5p表达可能是乔松素影响胃癌进展的重要途径之一，然后乔松素是对miR-34a-5p表达的影响是直接或间接尚不清楚。

研究报道激活 PI3K/AKT通路可上调转移相关蛋白MMP2、MMP9，进而促进AGS细胞的侵袭和迁移[13]，说明PI3K/AKT通路影响胃癌进展。此外，研究报道miR-34a-5p通过下调CDK6并使PI3K/AKT通路失活[14]。乔松素通过抑制PI3K/AKT/mTOR途径激活自噬可减轻糖皮质激素诱导的骨细胞凋亡[15]，说明miR-34a-5p和乔松素可调控PI3K/AKT通路。本实验结果显示，乔松素可降低p-PI3K、p-AKT蛋白的表达水平；而抑制miR-34a-5p表达逆转了乔松素对p-PI3K、p-AKT蛋白表达的影响。

综上所述，乔松素可能抑制胃癌AGS细胞增殖、迁移和侵袭，这种抑制作用可能是通过调节miR-34a-5p或PI3K/AKT通路实现的。