反复计划火烧对滇西北云南松林土壤细菌群落的影响1)

黄智豪 高玉婷 李政强 佘容 杨晓燕

(大理大学，云南·大理，671003)

微生物广泛分布于生物圈，在物质循环与能量流动中扮演着不可或缺的角色[1]；土壤微生物对森林生态系统的恢复、土壤肥力及土壤稳定性起着独特而又重要的作用[2], 为生态系统的重要组成部分[3]。计划火烧，是指利用可控的林火，对森林可燃物有计划、有目的、有步骤地进行烧除，以减少森林火灾的一项常用管理措施[4]。开展计划火烧，一方面，可以减少林地可燃物，以预防森林火灾的发生，从而达到保护野生动植物、森林资源、生态系统、保持水土等目的[5]；另一方面，可加速可燃物，即枯枝落叶等无机转化，增加土壤养分，改善植物及微生物的生长营养环境[6]，从而提高土壤微生物的物种优势度[7]，促进森林天然更新。但在实施计划火烧过程中，人们对植被、野生动物所受影响的关注度较高，而土壤微生物受到的影响关注较少。

火烧会对土壤微生物产生显著影响，主要表现为直接影响与间接影响。直接影响是当林火发生时使土壤温度急剧上升，导致土壤微生物直接死亡，生物量下降[8]；间接影响是指火烧改变了植被、土壤理化性质[9]，从而改变了土壤微生物的生存环境，进而间接影响土壤微生物，导致其生物活性和群落结构、物种多样性发生改变[8]。计划火烧是人为的控制性火烧，火烧强度小，单次计划火烧的研究表明，其对土壤微生物的影响不显著。但是，火灾对微生物的影响取决于很多因素，如火灾的严重程度和频率、土壤和植被类型等[10]。云南省是我国森林资源极其丰富的省份之一，森林覆盖率达63%[11]。云南省也是我国森林火灾的多发区与重灾区[12]，根据云南省森林火灾数据显示，从1990—2017年，共发生森林火灾10 912次，过火面积达2.75×105hm2[13]。在此严峻的形势下，计划火烧作为营林手段被广泛运用，且很多地区每隔2～3 a便会进行1次[14-15]。但是对于较高频率反复计划火烧对土壤微生物产生影响的研究较少。

为此，本研究以云南洱源县平头山经历了长期反复计划火烧的区域作为研究样区，以云南松(Pinusyunnanensis)林土壤为研究对象；2019年5月17日，在选定的反复计划火烧区域、非火烧区域(为对照)分别采集土样；应用高通量测序方法，分析实施反复计划火烧对云南大理洱源县云南松林地土壤细菌群落的影响；旨在为反复计划火烧措施的制定提供参考。

1 研究区域概况

本研究样方设置在云南省洱源县平头山(25°40′8.59″N，100°9′21.77″E)。该地区属北亚热带高原季风气候区，光照充足、干湿季节分明、四季恒温；年日照2 061～2 439 h，年均降水732 mm，年均气温13.19 ℃；土壤类型，主要为红壤、黄红壤、暗棕壤。森林的优势树种为云南松，树龄为23 a，林下植被有栎树(QuercusL.)、高山栲(Castanopsisdelavayi)、扭黄茅(Heteropogoncontortus)、穗序野古草(A． Chenii Keng)、钻叶火绒草(Leontopodiumsubulatum(Franch.) Beauv.)等。该区域在最近20 a间采用计划火烧进行森林大火的预防，其中有部分区域每2～3 a进行1次计划火烧，每次火烧均以去除地面草本植物为主要目的，火焰高度在0.4～0.5 m(数据来源于对当地护林员的走访调查结果)。本研究选择进行反复计划火烧的区域为研究样地，以相邻的、在最近10 a未受到计划火烧和自然火烧干扰的区域为对照样地。反复计划火烧区在采样时距其最近一次火烧的时间为3 a。两个样地均为东北坡的中坡位，海拔为2 000 m，坡度为28°。

2 研究方法

土壤样品的采集：样本采集时间为2019年5月17日。在选定的研究区域内(反复计划火烧区域、非火烧区域(为对照))分别各设置10 m×10 m样方1个，采用5点采样法(4角及中心)进行土壤样本采集，每个样区采集5份样本，合计10份。样本采集时，先去除表面枯枝落叶，保留腐殖质层，每个采样点各取土层0～5 cm土壤500 g，装入塑封袋，密封，低温保存备用。

土壤基因组DNA提取、文库构建、高通量测序方法：使用强力土壤DNA提取试剂盒(PowerSoil®DNA Isolation Kit)提取土壤样本含有的细菌基因组DNA；使用质量分数为1.2%的琼脂糖凝胶电泳检验抽提的基因组DNA质量，合格后送样至生工生物工程(上海)有限公司，使用Illumina Miseq平台进行测序，特异性引物选用341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)、805R(GACTACHVGGGTATCTAATCC)，扩增细菌V3～V4基因。

生物信息学与数据处理方法：对测序结果进行拼接、过滤、去嵌合等，得到优化序列，利用Usearch(Version 5.2.236)在97%的相似水平下对优化序列进行操作分类单元(OTU)注释。通过Mothur(Version 1.30.1)进行α多样性分析，采用R语言vegan 程序包(vegan package)进行群落整体差异非度量多维尺度(NMDS)分析、差异显著物种分析。

3 结果与分析

3.1 试验样地土壤样品细菌物种组成特征测序

反复计划火烧地与非火烧地的10个样品，经Illumina Miseq高通量测序后共获得973 893条有效序列，对原始数据进行处理后，共获得857 090条优化序列(反复计划火烧与非火烧处理分别为434 026条、423 064条)，各样品文库覆盖率均达到97%以上。稀释曲线总体趋于平缓(见图1)，表明测序深度合理，可以较好地反映样品中细菌的物种组成特征，更深的测序几乎不会产生更多新的操作分类单元(OTU)。

3.2 试验样地土壤细菌群落α多样性

由表1可见：反复计划火烧地土壤细菌群落丰富度指数(Ace指数、Chao1指数)、群落多样性指数(香农指数(Shannon index))，均显著低于非火烧地(P<0.05)；反复计划火烧地土壤细菌群落的辛普森多样性指数(Simpson index)更高，说明其均一性更好(P<0.05)。

表1 不同区域土壤细菌群落α多样性指数

3.3 试验样地土壤细菌操作分类单元(OTU)分布

在97%的相似水平下对优化序列进行操作分类单元注释，并对所得操作分类单元进行统计表明：2个区域10个样品共获得18 071个细菌操作分类单元，其中共有操作分类单元为7 288个，占操作分类单元总数的40.33%，说明反复计划火烧之后有较大一部分物种是可以恢复的；反复计划火烧地特有操作分类单元为3 839个，占操作分类单元总数的21.24%，可见反复计划火烧激发了新物种的出现。非火烧地特有操作分类单元为6 944个，占操作分类单元总数的38.43%，说明反复计划火烧改变了原有的物种组成。

3.4 试验样地土壤细菌群落中物种分布特征

从门水平看，在反复计划火烧地与非火烧地，土壤微生物细菌群落中共检测到34个门，优势菌(占门总数量比例>15%)依次为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)。但优势菌在反复计划火烧地与非火烧地土壤中占门总数量的比例存在差异：第一优势菌门变形菌门所占门总数量的比例，在反复计划火烧地与非火烧地中分别为26.26%、28.48%；第二优势菌门酸杆菌门所占门总数量比例，在反复计划火烧地与非火烧地中分别为18.71%、26.38%；第三优势菌门放线菌门所占门总数量比例，在反复计划火烧地与非火烧地中分别为22.43%、19.28%(见表2)。

表2 反复计划火烧区域(RB)、非火烧区域(UB)土壤细菌门的群落组成

由表3可见：在门水平上，反复计划火烧地与非火烧地中，其数量占门总数量比例差异较为显著的2个物种分别为酸杆菌门、放线菌门，其中，酸杆菌门在反复计划火烧地的数量占门总数量比例(18.71%)显著低于非火烧地(26.38%)，降低了1.41倍；而放线菌门在反复计划火烧地数量占门总数量比例(22.43%)显著高于非火烧地(19.28%)。反复火烧区域出现了非火烧地中未能检出的物种，其中数量占门总数量比例最高的是小基因组菌总门(Microgenomates)。结果表明：反复计划火烧，不同程度地改变了细菌门类结构组成，不利于变形菌门、酸杆菌门的生长，而有利于放线菌门的生长。

表3 反复计划火烧区域(RB)、非火烧区域(UB)土壤细菌门群落组成差异显著性

从属水平看，在反复计划火烧地与非火烧地，土壤细菌群落中共检测到550个属，排名前10的属分别为Gp1、Spartobacteria_genera_incertae_sedis、Gp2、Gaiella、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、链霉菌属(Streptomyces)、Gp6、分支杆菌属(Mycobacterium)、出芽菌属(Gemmata)、康奈斯氏杆菌属(Conexibacter)；在反复计划火烧地与非火烧地中这10个属合计共占总属数量的比例分别为35.19%、33.89%(见表4)。

表4 反复计划火烧区域(RB)、非火烧区域(UB)土壤细菌属的群落组成

由表5可见：在属水平上，不同属在反复计划火烧地和非火烧地中的分布也存在差异，其中差异较为显著的2个物种分别为分支杆菌属、出芽菌属。分支杆菌属，在反复计划火烧地的数量占总属数量的比例为3.35%、在非火烧地的数量占总属数量的比例为1.30%。出芽菌属，在反复计划火烧地的数量占总属数量的比例为2.60%、在非火烧地的数量占总属数量的比例为1.42%。而特有物种方面，反复火烧区也出现了多个非火烧区未能检出的物种，其中数量占总属数量比例最高的是异库兹涅尔氏菌属(Allokutzneria)。与门水平相似，反复计划火烧，不同程度地改变了细菌属水平上的结构组成。细菌群落结构组成的改变，进一步影响着细菌群落丰富度、多样性、均一性等，这与细菌群落α多样性分析结果相印证。

表5 反复计划火烧区域(RB)、非火烧区域(UB)土壤细菌属群落组成差异显著性

3.5 反复计划火烧地与非火烧地的土壤细菌群落差异

非度量多维尺度(NMDS)分析结果显示，土壤细菌群落按照反复计划火烧区域与非火烧区域分别聚集在一起，说明2个样品组内的样本间细菌群落组成相似，即组内样本间数据重复性较好；反复计划火烧区域与非火烧区域土壤细菌群落相互分离，说明2组样本有较显著的细菌群落组成差异；且协强系数(Stress)<0.05，表明结果具有较好的代表性。由此可见，反复计划火烧后土壤细菌群落发生了明显变化(见图2)。

4 讨论与结论

4.1 反复计划火烧对土壤细菌群落的影响

本研究表明，反复计划火烧地与非火烧地的微生物群落存在显著差异，且计划火烧降低了土壤微生物群落的物种丰富度、物种多样性。土壤细菌群落发生显著变化，其原因主要是因为反复计划火烧时的高温以及产生的灰烬改变了土壤理化性质(土壤水分、pH、通气性、温度等)，加速了有机氮转化为无机氮；而无机氮的添加和土壤理化性质的改变，会造成土壤微生物群落结构发生一定程度的变化[16-17]。另一方面，反复的计划火烧既会减少林下枯落物的载量，也能改变森林植物的组成，进而改变林下枯落物的种类，最终导致土壤生态环境的改变，并引起栖息其中的细菌群落的改变[18]。而细菌群落的多样性降低，则是因为以下原因：一是反复计划火烧降低了土壤的有机碳、养分等，缺乏相应的养分或碳源会导致细菌多样性的降低[19]；二是火烧会破坏土壤团粒结构，使得土壤板结，且火烧的次数越频繁土壤板结越严重[20]，土壤板结会导致土壤微生物多样性降低[21]。而物种丰富度、多样性的降低，说明土壤微生物群落的稳定性下降，这会间接影响生态系统的稳定性[22]。

4.2 反复计划火烧对不同细菌影响的程度不同

在反复计划火烧之后，酸杆菌门相对丰度比非火烧地下降了1.41倍，说明反复计划火烧不利于酸杆菌门细菌生长繁殖；原因是，酸杆菌门嗜酸，火烧使土壤pH增加[23]，导致其生活环境改变，不利于该门细菌生存[24]。酸杆菌门是土壤微生物家族重要的一员，其中的有些类群可以降解纤维素，对植物残体的降解起着重要的作用[25]。在厌氧的条件下，酸杆菌以Fe离子作为受体还原铁，参与铁循环[26]，具有光合作用的能力[27]。由此可见，酸杆菌门细菌在森林生态系统中发挥着重要的生态功能，在生态系统的恢复与构建、物质循环中起着重要的作用[28]。反复计划火烧显著降低其数量，会影响土壤生态系统的稳定。另外，在属水平上，反复计划火烧之后，分支杆菌属、出芽菌属2个优势属的相对丰度，比非火烧地均有所增加，说明反复计划火烧改变了土壤细菌属水平的群落结构分布，提高了某些细菌在属水平的群落丰富度；但二者的生态学功能尚未明确，需开展进一步的研究。综合看，反复计划火烧会改变土壤细菌群落结构，但变化明显的物种中有部分虽然已知其功能，是否会因其数量的变化导致整个生态系统的破坏尚未可知，毕竟对于物种多样性丰富的土壤微生物群落，个别物种的变化可以借助其他类群反映其相同的功能；另一方面，变化明显的物种中还有大量尚未明确其功能的物种，无法确定其数量的变化对土壤生态系统的影响。因此，在森林管理中，还应加强对其基础部分——土壤微生物群落的功能研究。

4.3 反复计划火烧后土壤细菌群落中出现多个特有种

本研究表明，虽然反复计划火烧降低了土壤细菌群落的多样性，但也出现了多个特有种，如小基因组菌总门、异库兹涅尔氏菌属等。原因是，反复的计划火烧改变了土壤生态系统中的生物环境，常规生境中优势物种因受到火的直接影响其生物量显著降低[29]，为其他因数量稀少而未能被发现的物种提供了生存空间[30]，其生物量增加，从而能被检测出；同时，也有研究表明，某些稀有物种受到火的直接刺激作用会大量繁殖[31-32]，因而增加了其被检出的概率。对其他生物群落的研究中也有类似的现象，如大型真菌Coprinellusangulatus、Lyophyllumatratum只在火烧后的土壤中被检出[33]；频繁低强度的火烧会使森林出现了原来生境中不存在的新蚂蚁物种[34]。但是，细菌的整体多样性在反复计划火烧后是降低的，而多样性的降低通常被认为是不利于生态系统稳定的。由此，本研究认为，这些仅在反复火烧的土壤中才出现的特有物种，对于恢复与维持土壤生态系统功能存在重要作用，是土壤生态系统受到反复火干扰后恢复和维持其生态功能的关键物种。因此，关于反复计划火烧对森林土壤细菌群落动态及其功能影响的研究还需要加强。