响应面法优化大蒜素提取工艺

赵婷，付君沐，尹怀宁，方尚玲，李小强*

(1.湖北工业大学 生物工程与食品学院，武汉 430068；2.湖北将军红健康产业股份有限公司，湖北 麻城 438399)

大蒜是百合科多年生草本植物的鳞茎[1-2]，富含功能性成分及营养价值[3]，被作为一种药食两用的植株[4]。大蒜在日常生活中通常被用于调味料，因其含有钾、钙、磷等微量元素以及多种人体必需氨基酸，被人们称为“天然抗生素”[5]，已普遍在食品、药品、养生等方面使用[6-7]。大蒜素是一种天然的活性物质[8]，其具有抑菌、防氧化、减少胆固醇等功能[9-10]，可以作为制作安全有益产品的最佳添加剂，代替抗生素；其次是用于肿瘤治疗的一种药物[11-14]。相关研究表明，新鲜的大蒜中并不直接含有大蒜素，而是含有蒜氨酸。蒜氨酸是一种在大蒜中并不稳定存在的大蒜素的前体物质[15-16]，其在大蒜细胞破裂时被释放并活化，催化蒜氨酸形成大蒜素。

综合国内外关于大蒜素提取的方法主要有3种：有机溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、超临界CO2萃取法。其中，有机溶剂提取法具有成本低、设备简单、操作简便、提取率高等特点，作为人们常用的提取方法，被用于食品、药品等领域[17]。水蒸气蒸馏法，虽然设备简易且使用方便，但在高温的蒸馏条件下会导致蒜氨酸酶失活，大蒜素提取效率较低。超临界CO2萃取法，具有高提取率、高质量的特点，但工艺成本高，不易作为制备高附加值食品的方法大规模投入工业化生产[18]。用于衡量大蒜及其加工产品质量的重要指标是大蒜素的含量。目前以大蒜为原料制作的深加工产品有很多，其中大蒜酒是利用酒精浸提半发酵法酿造的，其特点是无大蒜异臭味，能保持大蒜的清香，有抑菌的作用[19-20]。综合考虑，本实验采用乙醇作为有机溶剂提取大蒜素，可为后续开发大蒜酒、大蒜醋及大蒜膏等高附加值产品作准备。

续 表

从大蒜中提取大蒜素，需先破碎大蒜，经自然酶解，释放蒜氨酸酶并催化形成大蒜素。大蒜素的性质不稳定，易挥发，因此在提取工艺中料液比、酶解条件、提取时间等因素都会影响大蒜素的提取率[21]。利用大蒜素可与半胱氨酸反应的原理，通过DTNB法测定半胱氨酸前后的减少量，间接得出大蒜素的含量。在3种干、湿大蒜中选取大蒜素含量最高的一种大蒜为原料，通过对大蒜素提取率有影响的5个因素进行单因素实验，选取3个影响较大的因素结合响应面优化大蒜素的提取工艺条件，以确定最佳工艺。本研究为大蒜深加工产品的开发和大蒜素的工业化生产提供了一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

干、湿蒜(河北永年、山东金乡和四川彭州)：市售；食用酒精(95%)：武汉某酒厂提供。

1.2 试剂

半胱氨酸(C3H7NO2S)、Tris试剂：广州赛国生物科技有限公司；DTNB(5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸))：美国Sigma公司。

1.3 主要仪器与设备

AR3130电子分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；恒温摇床 上海智诚实验设备有限公司；5424R型高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；HH-6数显恒温水浴锅 浙江金坛市富华仪器有限公司；UV-2102型紫外可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 大蒜素的提取

将大蒜去表皮洗净，捣成泥状。取20 g蒜泥在一定温度下自然酶解一段时间，加入一定体积、浓度的乙醇溶液，放置于恒温摇床40 ℃、150 r/min振荡浸提蒜泥2 h，离心分离后取上清液，备用。

大蒜→去皮→捣碎→自然酶解→乙醇浸提→离心→上清液。

1.4.2 大蒜素的测定

根据DTNB法测定半胱氨酸含量原理[22]：

A0：0.5 mL V1+1 mL V2+3.5 mL V3→26 ℃保温15 min→于412 nm处测定吸光值。

A：0.5 mL V1+0.5 mL V4→26 ℃保温15 min→1 mL V2+3.0 mL V3→26 ℃保温15 min→于412 nm处测定吸光值。

其中，V1为半胱氨酸溶液(1.0 mmol/L)；V2为DTNB溶液(1.0 mmol/L)；V3为Tris-HCl缓冲溶液(50 mmol/L，pH 7.5)；V4为适量稀释的待测液。

根据半胱氨酸减少量计算出大蒜素含量，计算公式如下：

式中：△A412=A0-A；d为总稀释倍数；14150为NTB(2-硝基-5-硫代苯甲酸)在412 nm，1 cm光径摩尔消光系数。

1.4.3 不同品种大蒜的大蒜素测定

采用河北永年(湿蒜和干蒜)、山东金乡(湿蒜和干蒜)和四川彭州(干蒜)的大蒜为原料，测定其中大蒜素的含量，选取实验最佳品种。

1.4.4 单因素实验

分别确定料液比、酶解温度、酶解时间、乙醇浓度和浸提时间这5个单因素对大蒜素提取的影响，见表1。设计五因素五水平的单因素实验，测其大蒜素含量[23-24]。每组实验重复3次，取平均值。

表1 大蒜素提取工艺单因素实验

1.4.5 响应面优化实验

在单因素实验的基础上，选取对大蒜素提取效果影响显著的3个因素为自变量，以大蒜素为响应值(Y)进行响应面优化实验。利用Design Expert 8.0.6软件设计Box Behnken实验，确定最优的提取条件并进行实验验证[25]。

1.4.6 数据处理

采用GraphPad Prism 8.2.1软件对数据进行处理和作图，采用Design Expert 8.0.6软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同品种大蒜的大蒜素测定

由表2可知，比较3个不同品种的干、湿蒜的大蒜素含量，发现彭州干蒜的大蒜素含量最高，达到0.138 mmol/100 g。

表2 不同品种干、湿蒜的大蒜素含量

2.2 单因素实验结果

2.2.1 料液比对大蒜素提取的影响

料液比对大蒜素含量的影响见图1。

图1 料液比对大蒜素含量的影响

由图1可知，大蒜素含量随着料液比从1∶4～1∶6的增加而上升，当料液比为1∶6后大蒜素含量开始下降。原因是乙醇用量越多，大蒜素提取率越高，当料液比增加至一定比例时，大蒜素基本溶出，料液比再增加大蒜素含量有所降低可能是因为大蒜素是不稳定的硫化物，会有副产物溶出。所以，料液比在1∶6后大蒜素含量下降。因此，选择最佳料液比为1∶6。

2.2.2 乙醇浓度对大蒜素提取的影响

乙醇浓度对大蒜素含量的影响见图2。

图2 乙醇浓度对大蒜素含量的影响

由图2可知，随着乙醇浓度的升高，大蒜素含量缓慢上升，当乙醇浓度为85%时，大蒜素含量最高，为0.172 mmol/100 g。随后大蒜素含量下降，可能是因为乙醇浓度过高会导致蒜氨酸酶失活，生成的大蒜素减少。因此，选择最佳乙醇浓度为85%。

2.2.3 酶解温度对大蒜素提取的影响

酶解温度对大蒜素含量的影响见图3。

图3 酶解温度对大蒜素含量的影响

由图3可知，随着酶解温度的升高，大蒜素的含量呈现先增加后减少的变化趋势。大蒜素的提取含量在35 ℃酶解时最高，可达到0.160 mmol/100 g。蒜氨酸酶在低温条件下酶活性较低，催化大蒜素的形成不完全；但大蒜素在较高的温度下不稳定，易分解。因此，最佳的酶解温度为35 ℃。

2.2.4 酶解时间对大蒜素提取的影响

酶解时间对大蒜素含量的影响见图4。

图4 酶解时间对大蒜素含量的影响

由图4可知，随着酶解时间的延长，大蒜素的提取含量先增加，酶解30 min时大蒜素含量为0.162 mmol/100 g，达到最高，随后呈现减少的趋势。蒜氨酸在较短时间内并不能够充分转换成大蒜素，提取含量低。酶解时间过长，大蒜素不再生成，且大蒜素易挥发，整体含量下降。因此，选择最佳酶解时间为30 min。

2.2.5 浸提时间对大蒜素提取的影响

浸提时间对大蒜素含量的影响见图5。

图5 浸提时间对大蒜素含量的影响

由图5可知，随着浸提时间的延长，大蒜素的含量呈先增加后逐渐减少的趋势。大蒜素的含量在浸提时间为2 h时最高，为0.164 mmol/100 g。分析可能是前期浸提时间较短对大蒜素向乙醇相的转移有影响；而浸提时间过长时，已生成的大蒜素因其不稳定会挥发或分解成其他物质。因此，选择最佳浸提时间为2 h。

2.3 响应面优化实验结果

2.3.1 Box-Behnken设计与结果

在单因素实验结果的基础上，确定料液比(A)、浸提时间(B)、乙醇浓度(C)对大蒜素提取影响较大的3个因素为自变量，以大蒜素的含量(Y)为因变量。根据Box-Behnken设计的实验因素与水平见表3；响应面分析设计17个实验点，实验设计与结果见表4。

表3 Box-Behnken实验因素与水平

表4 Box-Behnken实验设计与结果

2.3.2 回归模型的建立及其显著性检验

利用Design Expert 8.0.6软件对表4的实验结果进行多元二次回归拟合，回归方程的方差分析结果见表5。

表5 响应面回归方程的方差分析

由表5可知，回归模型的F值为93.82，且显著性检验(P<0.0001)为极显著，失拟项(P=0.6781>0.05)为不显著，说明该模型具有可靠性。

利用响应面分析软件对表5中的数据进行回归拟合，得到大蒜素含量对自变量料液比、乙醇浓度、浸提时间的多元回归方程为：大蒜素=0.16+1.250E-004A-1.750E-003B+2.625E-003C+1.000E-003AB-4.250E-003AC+0.000BC-0.016A2-7.425E-003B2-3.175E-003C2，回归方程决定系数R2=99.18%，RAdj2=98.12%，表明该模型的预测值与实际值之间存在良好的可信度和拟合度，该方案结果可靠。

2.3.3 各因素响应面交互作用分析

利用响应面分析软件对二次响应面回归模型作出对应的响应曲面图，见图6。

a

由响应曲面图可以清楚地看出各因素之间存在交互作用。由图6可知，AB、BC和AC两者间均有显著的交互作用，因此响应面曲线的分析结果是准确的。

2.4 最佳提取条件的确定及验证

从上述回归模型中求得大蒜素的最佳提取条件：料液比为1∶5.94，浸提时间为1.88 h，乙醇浓度为87.28%。此条件下，模型预测值大蒜素含量为0.163 mmol/100 g。考虑到实际情况，调整条件为料液比1∶6、浸提时间2 h、乙醇浓度87%进行验证实验。结果表明，在最佳提取条件下大蒜素含量达到0.162 mmol/100 g，与预测值基本接近，说明所建模型拟合良好且可靠。

3 结论

本文以四川彭州大蒜为原料，选择乙醇有机溶剂提取大蒜素的工艺条件。通过料液比、酶解温度、酶解时间、乙醇浓度、浸提时间5个提取条件进行单因素实验，利用响应面实验对影响较大的3个因素进行优化，确定最佳提取工艺条件为：料液比1∶5.94、浸提时间1.88 h、乙醇浓度87.28%。考虑实际情况调整为料液比1∶6、浸提时间2 h、乙醇浓度87%，在此条件下进行验证，模型预测值大蒜素含量为0.162 mmol/100 g，比前期报道的提取大蒜素效果较好。该研究对大蒜素提取条件进行初探，后续可进行浓缩用于开发大蒜酒、大蒜醋、大蒜浸膏等功能性食品，为大蒜深加工产品的开发和大蒜素工业化的生产提供了一定的理论依据。