D型肉毒毒素灭鼠剂对棕背雪雀危害机理的试验研究

李生庆 李淑萍 胡国元 雷萌桐 韩生义 刘成录 王林业

(1.青海大学畜牧兽医科学院，西宁，810016；2.青海省动物疾病病原诊断与绿色防控技术研究重点实验室，西宁，810016；3.青海省果洛州玛沁县兽医站，玛沁，814000；4.青海省互助县红崖子沟乡畜牧兽医站，互助，810500)

青藏高原草地生态系统由于气候环境、人为干扰和家畜载畜量的超载等多方面因素而处于比较严重的退化状态，同时显现的还有草地沙化、黑土滩化的面积不断加大，鼠密度极高，使得鼠害防治强度逐年增加。随着D型肉毒毒素生物灭鼠剂在青藏高原牧区，尤其是被誉为“高原水塔”的三江源地区草地鼠害治理中的大面积应用，药物对处于敏感生态地位中的有害靶动物的特异性靶向作用及对非靶环境动物的安全性备受生态学者的重视。

由于青藏高原牧区大都没有树木和高的灌木丛，隐蔽条件差，气候寒冷，特别是在海拔4 000 m以上的地方几乎终年无夏，夜间气温常在0 ℃以下，加上大风等不利自然因素，使褐背拟地鸦(Pseudopodoceshumilis)和棕背雪雀(Pyrgilaudablanfordi)等小型鸟类适应性地利用高原鼠兔(Ochotonacurzoniae)的洞穴栖息或繁衍后代，形成了“鸟鼠同穴”。

肉毒毒素作为一种生物灭鼠剂，在三江源地区草地鼠害防治中取得了良好的效果，有效控制了害鼠的种群密度，为黑土滩治理和草地植被恢复奠定了良好的基础[1-2]。评价一种灭鼠药物的好坏，不仅要关注其药物效果，更要达到相关的药物毒性分级标准，尤其是在青藏高原地区，独特的自然环境孕育了丰富的生物资源，维持生态环境的健康发展对于该区域生态环境的保护利用至关重要[3]。随着D型肉毒毒素灭鼠剂的广泛使用，新的问题也不断被发现，在生态环境敏感的区域大面积使用D型肉毒毒素灭鼠剂，呈现出了一定的敏感性差异现象，且在传统的动物致死性试验无法逐一对野生保护动物进行测定的情况下，如何对非靶动物的安全性进行评价，研究不同动物对D型肉毒毒素产生敏感性差异的内在机理和影响因子就显得尤为重要。藉此建立毒素安全性评价模型，在更广的范围对不同动物的安全性实现快捷地安全性评价具有很高的理论研究及实际应用意义。

为了探究D型肉毒毒素对高原牧区小型鸟类的毒性作用，阐明D型肉毒毒素蛋白导致高原牧区小型鸟类死亡的真实原因，本研究采用霍恩氏法测定了D型肉毒毒素对青藏高原牧区野生高原鼠兔、高原鼢鼠(Myospalaxbaileyi)、青海田鼠(Lasiopodomysfuscus)和小型鸟类棕背雪雀的灌胃半数致死量(LD50)，并从分子角度开展了基于VAMP1蛋白的敏感性分析。研究结果可为鼠害防治区域内相关鸟类的安全性评价提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验用菌株和毒素

D型肉毒梭菌D8901株，由青海大学畜牧兽医科学院兽医研究所肉毒研究室提供。D型肉毒灭鼠剂2021001批和2021002批，毒价1 000万MLD/mL(小白鼠静注)，由青海绿原生物工程有限公司提供。

1.2 试验用动物

大白鼠(Rattusnorvegicus)，购自中国农业科学院兰州兽医研究所小动物实验中心，共计25只，体重130.32～150.64 g。

高原鼠兔，捕捉自青海省海北州祁连县野牛沟乡达玉村野外牧区，共计25只，体重125.26～153.31 g。在室内人工饲养1周后供实验室用。

棕背雪雀，捕捉于青海省果洛州玛沁县草原，共计40只，体重21.66～43.62 g，在室内饲喂1周稳定后供试验用。

高原鼢鼠，捕捉自青海省大通县东峡镇向华乡农区，共计25只，体重245.62～283.24 g。在室内人工饲养1周后供实验室用。

青海田鼠，捕捉自青海省海北州刚察县青海湖农场，共计25只，体重23.50～34.60 g。在室内人工饲养1周后供实验室用。

昆明系小鼠，购自兰州兽医研究所小动物实验中心，体重16.00～18.00 g。

1.3 D型肉毒毒素对棕背雪雀灌胃LD50的测定

灌胃LD50的测定按霍恩氏法进行。根据鹌鹑(Coturnixjaponica)的灌胃半数致死量及前期预试验结果，将试验设为2个重复(2个批次的药品)，每个重复20只棕背雪雀，各分为4个剂量组，每组5只，根据棕背雪雀的体重灌服系列浓度毒素0.05 mL/g，剂量分别为10 000、21 500、46 400、100 000 MLD/mL，按体重、组别逐一灌服。观察7～10 d，记录死亡情况。

1.4 棕背雪雀胃肠内容物对D型肉毒毒素蛋白的破坏强度分析

试验用棕背雪雀乙醚麻醉致死后，取胃、肠内容物分别置于离心管中，加入4 mL生理盐水稀释摇匀，再加入D型肉毒毒素(2 000万MLD/mL)1 mL，充分混匀，使其终浓度为40万MLD/mL，室温保存24 h后离心、稀释并测毒(原液未处理组)。另取胃、肠内容物分别置于离心管中，加入4 mL生理盐水稀释摇匀，4 ℃放置2 h后，4 000 r/min离心20 min，转移至另一离心管中，再加入毒素(2 000万MLD/mL)1 mL，充分混匀，室温保存24 h后离心、稀释并测毒(离心处理组)。

1.5 VAMP1蛋白转录组测序分析

将棕背雪雀、高原鼠兔、高原鼢鼠及青海田鼠麻醉后，进行心脏采血致死和快速解剖，取新鲜脑组织置于采样管中，加入适量干冰保存，送样至北京百迈客生物科技有限公司，按标准流程进行样本制备并上机构建文库。使用Illumina Hiseq高通量测序平台对cDNA文库测序、组装和序列比对，得到的mapped reads用于下游分析。从GenBank中下载小鼠(Musmusculus，NM-013090.2)和大白鼠(NM-009496)的VAMP1基因的编码区序列，再用BLAST+软件包中的Blastn程序调取各物种包含VAMP1基因的unigene序列。最后用DNA Star软件包(http：//www.dnas-tar.com/)中的Megalign软件分析DNA序列和氨基酸序列的相似性。

2 结果与分析

2.1 D型肉毒神经毒素对棕背雪雀灌胃LD50

两批次D型肉毒毒素对棕背雪雀灌胃LD50分别为3.16万MLD/kg(95%可信限为2.05万～4.88万MLD/kg)和2.71万MLD/kg(95%可信限为1.69万～4.41万MLD/kg)，平均为2.94万MLD/kg(表1)。

表1 棕背雪雀对D型肉毒毒素敏感性(LD50)

2.2 棕背雪雀与鼠类胃肠内容物对D型肉毒毒素的破坏强度

取1 mL原毒价为2 000万MLD/mL的D型肉毒毒素分别置于加有4 mL生理盐水的棕背雪雀、大白鼠及高原鼠兔胃肠内容物原液及离心上清液中，使其终浓度为40万MLD/mL，作用24 h后，可发现不同处理组中肉毒毒素含量均有不同程度的降低，具有3个特点：(1)大白鼠胃肠内容物对D型肉毒毒素的破坏强度明显高于高原鼠兔及棕背雪雀。(2)高原鼠兔及棕背雪雀胃肠内容物对D型肉毒毒素的破坏强度基本相当。(3)胃肠内容物离心后的上清液对肉毒毒素的破坏强度明显低于胃肠内容物原液(表2)。

2.3 棕背雪雀与高原牧区部分害鼠VAMP1蛋白转录组的测序分析

通过采样转录组测序得到高原鼠兔、青海田鼠、高原鼢鼠和棕背雪雀的VAMP1基因编码区序列，长度均为357 bp，与小鼠VAMP1基因序列在DNA序列水平上进行逐一比对，结果显示：高原鼠兔与小鼠的相似性为90.96%～94.44%；高原鼢鼠与小鼠的相似性为94.12%～96.44%；青海田鼠与小鼠的相似性为94.03%～98.35%；与高原鼠兔同穴而居的棕背雪雀的测序结果比对，发现与小鼠的序列同源性为83.72%～90.28%。在基因编码区序列推导的氨基酸序列水平上，3种鼠类及棕背雪雀VAMP1氨基酸序列(GenBank No.GQ905710)与小鼠的完全相同，VAMP1氨基酸序列在第48号氨基酸位点(为48M型，而非48Ⅰ型)都属于D型肉毒毒素敏感型氨基酸(图1)。

图1 棕背雪雀、高原鼠兔与部分啮齿类动物体内VAMP1氨基酸序列比对结果Fig.1 Alignment of VAMP1 amino acid sequences between plain-backed snowfinch，plateau pika and rodents

3 结论与讨论

本研究中，采用霍恩氏法测得与高原鼠兔同穴而居的棕背雪雀对两批次D型肉毒毒素的半数致死量分别为3.16万、2.71万MLD/kg，平均半数致死量为2.94万MLD/kg，敏感性介于高原鼢鼠(LD50为0.58万MLD/kg)[4]与青海田鼠(LD50为5.64万MLD/kg)之间[5]，表明在使用D型肉毒毒素进行草原鼠害防治时，同域分布的小型鸟类存在误食毒饵引起死亡的危险，今后在毒饵投放精准性、饵料趋避方面有必要采取相应措施。

由于小分子靶向药物多为口服制剂，生物利用度容易受到食物的影响[6-7]。食物可通过影响胃肠血流、胃排空、肠蠕动、胃肠pH以及P-蛋白来影响小分子靶向药物的吸收，进而影响药物的口服效果。不同动物胃肠内容物对D型肉毒毒素蛋白均有一定程度的破坏，胃肠内容物对毒素的破坏强度与毒素对害鼠的敏感性成正相关。本研究表明，大白鼠胃肠内容物对D型肉毒毒素的破坏强度明显强于高原鼠兔及棕背雪雀，后两者胃肠内容物对D型肉毒毒素的破坏强度基本相当，验证了胃肠内容物的破坏作用是导致害鼠对药物敏感性降低的原因之一。

D型肉毒毒素灭鼠剂自研制成功以来已推广使用多年，累计防治面积已达1 686万hm2，但主要用于高原鼠兔的大面积防治，虽然对高原鼢鼠、青海田鼠均开展了相应的研究工作，但在更大范围及其他鼠种上还缺乏更多的数据支撑。肉毒毒素之所以能引起动物的中毒死亡，主要是因为能够靶向切割其血清型相对应的底物蛋白[8]。鉴于此，国内外很多学者都开展了肉毒毒素活性体外分析的相关研究，如化学合成底物蛋白的多肽并应用于肉毒毒素活性的测定[9]，通过将肽段与GST标签融合表达后得到重组多肽底物[10]等。根据罗森等[11]的研究可知，小鼠与人体内VAMP2基因编码的氨基酸同源性大于99%，因此在研究中利用小鼠的VAMP基因序列作为替代进行了VAMP2蛋白的基因表达重组。利用肉毒毒素靶向切割重组VAMP1蛋白的方法可用于今后其他非靶向动物体内D型肉毒毒素底物蛋白的重组构建[12-13]，利用D型肉毒毒素进行靶向切割，间接证实D型肉毒毒素对不同动物的安全性。本研究利用转录组测序的方法，分析青藏高原地区草地生态系统中高原鼠兔、高原鼢鼠、青海田鼠和棕背雪雀的VAMP1序列信息，结果显示高原鼠兔及棕背雪雀体内VAMP1蛋白的基因序列与小鼠VAMP1序列高度一致。大白鼠体内VAMP1蛋白氨基酸序列中的第48、60、61位氨基酸位点均发生突变，尤其是第48位点均为M型，而非Ⅰ型[14]，即高原牧区棕背雪雀对D型肉毒毒素具有一定的敏感性，在现地鼠害防治中应精准控制鼠药投放剂量，建议采取药物警戒色趋避鸟类采食毒饵，提高其环境动物安全性。通过底物蛋白的敏感性分析，可获知鼠害防治区域内相关动物的安全性评价，并借助改良毒饵投放方法或可以在不伤害其他野生动物(肉毒毒素非靶动物)的前提下，指导区域鼠害防治规划及具体实施。