菠萝AcSOC1基因调控因子筛选

金顺达，胡福初，王祥和，李玉静，范鸿雁，罗志文，张治礼，陈 哲

菠萝基因调控因子筛选

金顺达1,2，胡福初2，王祥和2，李玉静2，范鸿雁2，罗志文2，张治礼2*，陈 哲2*

1. 海南大学园艺学院，海南海口 570228；2. 海南省农业科学院热带果树研究所/海南省热带果树生物学重点实验室/农业农村部海口热带果树科学观测实验站，海南海口 571100

菠萝（）是我国热区种植的主要经济作物之一，农业种植上常通过施用乙烯利促其成花，但关于乙烯诱导菠萝成花的分子机制与植物体内已知的五大成花途径之间关系尚不清楚。（）是一种开花整合因子，能够整合多种成花信号，诱导植物成花。有实验数据显示，（XM_020238379.1）基因响应乙烯诱导，在乙烯处理菠萝后，表达量上升。为了深入了解在菠萝成花中的作用及乙烯诱导菠萝成花与五大成花途径之间的关系，本研究以乙烯敏感品种‘台农4号’为材料，克隆启动子，构建pAbAi-pAcSOC1诱饵载体，利用酵母单杂技术，筛选候选调控因子，并用双荧光素酶实验进行验证。结果显示：共筛选出4个候选转录的调控因子∶（）（）（）（）只有与pAcSOC1存在互作关系。是一种开花抑制因子，乙烯能够抑制菠萝基因表达。因此推断认为，乙烯诱导菠萝成花，可能是通过抑制基因实现的，即乙烯通过抑制的表达，从而降低了对表达的抑制作用，表达增强，加快了乙烯诱导成花的过程。

菠萝；乙烯诱导；开花调控；调控因子

菠萝又名凤梨（），为凤梨科凤梨属多年生草本植物，是一种典型的亚热带植物[1]。我国是菠萝主要产地之一，种植面积和产量分别约占全球总量的7.2%和8.1%[2-3]。海南气候温润，适合菠萝种植，其产量约占全国产量的26.8%，已逐渐成为我国菠萝主产区之一[4-5]。

开花是植物由营养生长向生殖生长转变的重要标志之一，通常伴随着植物形态及生理生化的变化，如生殖器官发生、果实发育、内源激素变化等。菠萝开花可分为自然开花和人工诱导开花两大类[6]。自然开花，即菠萝生长到合适状态，经过自然低温诱导后自然成花。由于自然成花受到菠萝生长状态、气候等环境因素影响较大，常常导致成花时间不一致，果实成熟时间和采收时间不一致，进而导致上市时间不确定等给种植户造成困扰和经济损失。因此，农业生产上常常避开菠萝自然成花季节，通过施用乙烯利或电石等诱导菠萝提前成花[7-9]。植物开花受内部因素（赤霉素等激素）和外部因素（水分、温度、光照等环境因素）的调控[10]。遗传学和分子生物学分析结果发现，拟南芥开花的调控信号最终均汇集到少数几个调控因子如（）（）等发挥作用。是重要的开花整合因子。前人研究发现，基因受（）、、、（SQUAMOSA promoter binding-like）、等基因直接或间接调控，整合来自光周期、温度、激素、年龄途径等的开花信号[11-12]。LIU等[13]在梨树中分离并鉴定出2个同源基因和，在拟南芥中过表达可以促进拟南芥花期提前；SONG等[14]在蓝莓中发现并鉴定了一个同源基因，超表达转基因蓝莓表现出早花现象。

酵母单杂系统创立于1993年，目前已经发展成为一种成熟的技术并被广泛应用于DNA与蛋白质互作[15]、转录因子筛选的研究中[16-20]。前期已有研究数据显示，施用乙烯利可上调菠萝基因的表达。为深入了解在乙烯诱导菠萝成花中的作用，本研究采用乙烯敏感型菠萝品种‘台农4号’克隆启动子序列，利用酵母单杂系统筛选上游转录调控因子，再通过双分子荧光素酶实验验证筛选出的转录因子与pAcSOC1的互作关系。研究结果将为进一步阐明乙烯诱导菠萝成花的分子基础及其与已知植物成花途径之间的关系、揭示菠萝成花调控的分子机制提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及处理 ‘台农4号’菠萝种植于海南省澄迈县美亭村菠萝大棚种植基地。大棚室内温度为25℃左右，湿度为70%～80%，其他环境条件均控制在菠萝适宜生长环境范围内。选取株龄1 a、生长状态基本一致、拥有30片左右成熟健康叶片（叶长约35 cm）的菠萝植株作为催花处理对象。

催花处理：用80 mL的40%乙烯利300倍液灌心。

取样及处理：催花处理后1、2、3、4、5、6、7、24 h分别取菠萝植株茎尖（每个样品均取自不同植株，3个生物学重复），液氮速冻后贮存于–80℃超低温冰箱，备用。不催花的植株作为对照。

本氏烟草种植于RLD-1000E-4人工气候箱中，光周期：光照16 h，黑暗8 h，温度23～25℃。

1.1.2 菌株和载体 大肠杆菌DH5α感受态、农杆菌GV3101感受态购自上海维地生物技术有限公司，酵母Y1HGold菌株由Clontech酵母试剂盒提供，pAbAi诱饵载体由Clontech酵母单杂试剂盒提供，双荧光素酶载体pGreen II 62-SK、pGreen II 0800-LUC由海南大学夏薇老师馈赠。

1.1.3 主要试剂 SD缺素培养基、LB培养基购自北京酷来搏科技有限公司，高保真DNA聚合酶购自南京诺唯赞生物公司，dⅢ、Ⅰ限制性内切酶购自NEB公司，T4连接酶购自莫纳生物公司，TOPO连接试剂盒购自艾德莱生物公司，双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海翊圣生物科技股份有限公司，MatchmakerTMGold Yeast One-Hybrid Library Screening System、Advantage 2 PCR Kit购自TaKaRa公司。引物合成及测序均由广州天一辉远公司完成。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 称取等量的、催花处理后不同时间取样的菠萝茎尖组织样品（包括对照植株），混合后RNA提取参照福记多酚多糖RNA提取试剂盒说明书进行。超微量分光光度计测定RNA浓度和纯度，1%琼脂糖凝胶电泳分析RNA完整性。

1.2.2 诱饵载体构建及诱饵酵母转化 根据Plant CARE预测的结果[21]，避开顺式元件区，可将启动子区域（–1800～0 bp）分为4部分，依次命名为pAbAi-AcSOC1-1、pAbAi-AcSOC1-2、pAbAi-AcSOC1-3和pAbAi-AcSOC1-4。根据启动子序列和载体序列特征，设计包含dⅢ和Ⅰ酶切位点的引物（表1）。以‘台农4号’菠萝植株叶片DNA为模板，利用pAbAi-AcSOC1-1F /pAbAi-AcSOC1-1R、pAbAi-AcSOC1-2F/pAbAi- AcSOC1-2R、pAbAi-AcSOC1-4F/pAbAi-AcSOC1- 4R和pAbAi-AcSOC1-4F/pAbAi-AcSOC1-4R引物进行扩增。PCR扩增产物和pAbAi载体进行双酶切、连接、转化后，得到诱饵载体pAbAi- AcSOC1-1、pAbAi-AcSOC1-2、pAbAi-AcSOC1和pAbAi-AcSOC1-4。测序无误后，提取质粒，使用I单酶切，纯化，转化至酵母感受态Y1HGold中（方法参考维地Y1HGold转化说明书）。

1.2.3 自激活验证 从分别含有不同诱饵载体的诱饵菌株培养皿上挑取单菌落，分别转移至液体培养基中培养（30℃、250 r/min）至600为0.002时，吸取100 μL分别涂布在含有AbA抗生素的SD/-Ura固体培养基上培养（设置0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 ng/mL等10个AbA浓度）。培养3～5 d后，根据不同抗生素浓度平板酵母菌落长势，确定4种诱饵菌株的自激活强度。

1.2.4 cDNA文库构建及质量检测 以菠萝茎尖组织混合样品RNA为模板，参照SMART试剂盒、Advantage 2 PCR Kit提供的方法构建不同催花时间菠萝茎尖组织cDNA文库[22]。文库滴定浓度：将文库菌株梯度稀释100倍、1000倍、10 000倍，分别涂布在含有对应AbA抗生素浓度的SD/-Ura平板上，30℃培养3～5 d后统计平板上菌落数目。文库滴度计算参考杨成君等[23]的方法。重组率：根据pGADT7载体序列特征设计引物pGADT7F和pGADT7R（表1）。随机挑取24个单菌落进行菌落PCR检测，根据凝胶成像系统分析扩增条带大小，并计算重组率[24]。

表1 引物汇总

1.2.5 互作因子的筛选与点对点互作蛋白验证 参考MatchmakerTMGold Yeast One-Hybrid Library Screening System方法，提取阳性克隆质粒，转化进入大肠杆菌后测序；测序后，利用NCBI进行序列比对；去除冗余后将对应序列的质粒转化对应的诱饵酵母，涂布在SD/-Leu、SD/-Leu/AbA平板上，培养3～5 d观察菌落生长状态。

1.2.6 双荧光素酶实验 以pLUC-SOC1-F/pLUC- SOC1-R为引物，启动子质粒为模板，方法同1.2.2，构建pLUC-SOC1重组载体。同理，以AcSVP1-F/AcSVP1-R、AcSVP2-F/AcSVP2-R为引物，以上述提取质粒为模板，构建双荧光素酶表达载体p62-SK-AcSVP1和p62-SK-AcSVP2。测序验证无误后，提取质粒，转化到农杆菌GV3101中（方法参考维地生物GV3101说明书）。28℃培养2～3 d后，挑取单菌落PCR鉴定无误后，28℃，250 r/min摇菌过夜。菌液按照600的比值1∶9，将包含pLUC-SOC1载体的农杆菌分别与包含p62-SK-AcSVP1、p62-SK-AcSVP2载体的农杆菌混合。同时以pLUC-SOC1与pGreen II 62-SK混合菌液作为空白对照，农杆菌侵染方法参考LI等[25]的方法。暗培养1 d，正常培养36 h后测定海肾和萤火虫2种萤光素酶的活性（测定方法参考双荧光素酶报告基因检测试剂盒），计算二者比值[26]。使用SPSS软件对数据进行统计学分析，利用Origin 2018绘图。

2 结果与分析

2.1 RNA质量分析

利用福记多酚多糖RNA提取试剂盒提取RNA，使用超微量分光光度计检测RNA纯度，260280=1.91，260230=2.03。经过1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外线下能够清楚地看到2条明亮的条带，且无弥散，表明所提取的RNA质量和完整型可满足建库要求。

2.2 诱饵载体的构建

从生长3～4 d包含诱饵载体的酵母平板上挑取单克隆，使用诱饵载体特异性引物经菌落PCR检测，条带大小与预期相符（图1），表明诱饵酵母转化成功。

M: DL2000 DNA marker; 1: pAbAi-SoC1-1; 2: pAbAi-SoC1-2; 3: pAbAi-soC1-3; 4: pAbAi-SOC1-4 decoy carrier.

2.3 诱饵酵母自激活验证

将诱饵酵母菌涂布在SD/-Ura/AbA培养基上，pAbAi-AcSOC1-1、pAbAi-AcSOC1-2、pAbAi- AcSOC1-3、pAbAi-AcSOC1-4诱饵酵母分别在200、800、200、400 ng/mL的AbA的选择压力下，自激活得到抑制（图2）。因此，选择200、800、200、400 ng/mL的AbA浓度分别作为对应诱饵酵母文库筛库压力。

2.4 酵母单杂系统cDNA文库量检测

以提取获得的‘台农4号’RNA为模板，利用SMART技术合成第一链cDNA，再经LD-PCR技术获得双链dsDNA，通过1%琼脂糖凝胶电泳分析，扩增得到的双链dsDNA与阴性对照一致，满足酵母单杂建库要求。

图2 诱饵酵母在SD/-Ura/AbA培养基自激活验证

统计文库稀释后平板上长出的菌落数目，计算可得文库滴度为3.21×107CFU/mL（图3）；共检测出24个阳性克隆，得到cDNA插入片段约1000 bp，重组率为100%（图4）。表明此文库可满足酵母单杂筛库要求。

A：100 μL文库菌液；B：100 μL稀释10倍的文库菌液；C：100 μL稀释100倍的文库菌液。

M：DL5000 DNA marker；1～24：24个克隆的菌落PCR产物。

2.5 酵母单杂交初筛结果

从SD/-Ura/AbA平板上挑取阳性单克隆，测序去重后共得到4个单一序列，经NCBI数据库Blast比对后，依次为类基因（表2）。通过酵母单杂交点对点验证这4种蛋白与AcSOC1启动子的互作关系，结果表明，pGADT7-AP1、pGADT7-GHDP载体转化进入诱饵酵母后，能够在SD/-Leu培养基上生长，但不能在SD/-Leu/AbA平板上生长；pGADT7-SVP1、pGADT7-SVP2载体转化进入诱饵酵母后，在2种培养基上均能生长（图5）。表明与启动子无互作关系，而与启动子存在互作关系。

表2 酵母单杂初筛结果

2.6 双荧光素酶验证

为进一步探究菠萝启动子与的互作关系，本研究克隆了、基因（图6），并构建了含有pAcSOC1+萤火虫萤光素酶报告基因+海肾萤光素酶报告基因的pGreen II 0800-LUC载体，以及62-SK-AcSVP1、62-SK-AcSVP2、0800-LUC-SOC1载体，分析其在烟草叶片中的瞬时表达情况，结果见图7。与对照组相比，实验组荧光信号强度显著弱于对照组。这表明可与启动子结合，并降低启动子的活性。

1：10 μL菌液；0.1：10 μL菌液10倍稀释；0.01：10 μL菌液100倍稀释。

3 讨论

菠萝是我国热区的经济作物之一，其开花时间直接决定其上市时间，进而影响菠萝种植户的经济收入。植物成花是一个复杂的系统，受外部环境和自身因素等多方面的调控，这些调控方式在植物体内形成了一个精密而复杂的调控网络，但最终被整合到几个关键的基因上，这些基因被称为开花整合因子[11]。基因是家族中的一员，编码一种转录因子。前人研究发现光照可影响mRNA的稳定性，而是基因的上游调控因子，在光周期途径中与形成二聚体，影响SOC1的表达[27]；春化途径和自主途径中的直接或形成阻遏复合体与启动子结合，抑制其转录，调控开花[28-30]；在研究GA调控途径中发现，DELLAs蛋白可与竞争NF-Y结合位点，进而影响SOC1的表观遗传活性。当GA存在时，DELLAs蛋白会被降解，表达量上调[31]；年龄途径中microRNA随着年龄的增加，表达量降低，对的抑制作用减弱。可与第一个内含子结合上调其表达水平，促进开花。同时，对及其同源基因研究发现，通过调控等花器官基因，影响植物花形态的发生[10]。总结前人的研究发现，广泛参与成花的各种途径之中，在开花调控中起着“承上启下”的作用，是开花整合因子之一。通过前人的研究，的调控机制得到了一定的解释，但是关于乙烯诱导菠萝成花过程中的调控机制尚不清楚。因此，本研究利用酵母单杂交技术在乙烯处理的菠萝中筛选调控因子。

图6 AcSVP1与AcSVP2多序列比对

CK：pLUC-SOC1+pGreen II 62-SK；AcSVP1：pLUC-SOC1+p62-SK-AcSVP1；AcSVP2：pLUC-SOC1+p62-SK-AcSVP2；不同小写字母表示不同处理间差异显著（P<0.05）。

为了研究清楚基因在菠萝中的调控机制，本研究利用酵母单杂交技术，对上游转录调控因子筛选，成功筛选出2个转录因子。通过对及其同源基因[32][33]等研究发现，是一种开花抑制因子[34]，主要在春化途径、赤霉素途径、自主途径等开花调控途径中发挥作用，整合来自植物体内和外界环境的调控信号，抑制等开花整合因子的表达，维持植物处于营养生长的状态。LI等[35]研究发现响应温度信号，与形成复合物抑制下游开花基因表达，调控植物成花；在GA途径中，通过抑制的表达，降低植物体内GA含量；陈娇等[36]研究表明是上游调控基因，在成花过程中抑制，从而延迟开花。可与春化途径中的相互作用形成阻遏复合体，直接结合到启动子上，抑制其转录。除此之外，LEE等[37]研究表明参与染色质的表观遗传修饰，使染色质处于不活跃的状态。李玉静等[38]在乙烯诱导菠萝成花研究中，发现乙烯处理后表达水平下降，菠萝成花加速。

本研究还分析了、对启动子活性的影响。结果表明，对启动子活性有明显的抑制作用，初步推断，在菠萝中可与基因启动子结合，并抑制其活性。乙烯处理菠萝后，表达量下降，其对启动子的抑制作用降低，启动子活性增强，表达量上升，作用于下游成花基因，促进菠萝成花。

本研究通过酵母单杂交技术，筛选出的2个上游转录因子，并利用双荧光素酶技术验证了其对于启动子的作用。该结果对在菠萝成花过程中的作用和地位研究提供了新的思路和线索，为进一步阐明乙烯诱导菠萝分子机理奠定了基础。但由于是一种开花整合因子，受多种途径的调控，因此本研究结果只是基因众多调控途径中的一部分，如需全面了解基因在菠萝成花中的作用仍需更多的实验数据来阐述。

[1] 邹益民. 菠萝栽培及病虫害防治技术探讨[J]. 农技服务, 2017, 34(9): 47.

ZOU Y M. Discussion on pineapple cultivation and pest control technology[J]. Agricultural Technology Service, 2017, 34(9): 47.(in Chinese)

[2] 金 琰. 我国菠萝市场与产业调查分析报告[J]. 农产品市场, 2021(8): 46-47.

JIN Y. Investigation and analysis report on my country’s pineapple market and industry[J]. Agricultural Products Market, 2021(8): 46-47. (in Chinese)

[3] 金 琰, 侯媛媛, 刘海清. 中国菠萝产业市场定位及拓展策略研究[J]. 热带农业科学, 2016, 36(7): 64-67.

JIN Y, HOU Y Y, LIU H Q. Market positioning and development strategy of pineapple industry in China[J]. Chinese Journal of Tropical Agriculture, 2016, 36(7): 64-67. (in Chinese)

[4] 刘传和, 贺 涵, 何秀古, 邵雪花, 赖 多, 匡石滋, 肖维强. 我国菠萝品种结构与新品种自主选育推广[J]. 中国热带农业, 2021(4): 13-15.

LIU C H, HE H, HE X G, SHAO X H, LAI D, KUANG S Z, XIAO W Q. Pineapple cultivar structure and extension of new independent breeding pineapple cultivars in China[J]. China Tropical Agriculture, 2021(4): 13-15. (in Chinese)

[5] 刘传和, 贺 涵, 匡石滋, 肖维强, 邵雪花, 赖 多. 菠萝优质高效种植“12(2)3”模式[J]. 中国热带农业, 2020(1): 75-78.

LIU C H, HE H, KUANG S Z, XIAO W Q, SHAO X H, LAI D. The high efficiency planting model “12(2)3” for pineapple[J]. China Tropical Agriculture, 2020(1): 75-78. (in Chinese)

[6] 张治礼, 范鸿雁, 华 敏, 何 凡. 菠萝开花诱导及其生理与分子基础[J]. 热带作物学报, 2012, 33(5): 950-955.

ZHANG Z L, FAN H Y, HUA M, HE F. Induction of pineapple flowering and underlying physiological and molecular bases[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2012, 33(5): 950-955. (in Chinese)

[7] 张红娜, 刘胜辉, 孙伟生, 李运合, 孙光明, 林文秋, 张秀梅, 吴青松. 菠萝对乙烯利诱花的敏感性差异研究[J]. 热带作物学报, 2018, 39(6): 1087-1094.

ZHANG H N, LIU S H, SUN W S, LI Y H, SUN G M, LIN W Q, ZHANG X M, WU Q S. Ethylene induced sensitivity of difference pineapple varieties[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2018, 39(6): 1087-1094. (in Chinese)

[8] 刘胜辉, 李运合, 杨玉梅, 张秀梅. “台农17”菠萝夏季催花技术研究[J]. 中国南方果树, 2019, 48(3): 73-75.

LIU S H, LI Y H, YANG Y M, ZHANG X M. Research on flower-inducing technology of “Tainong 17” pineapple in summer[J]. South China Fruits, 2019, 48(3): 73-75. (in Chinese)

[9] 周 迪, 张秀梅, 陈 妹, 杜丽清, 姚艳丽, 吴建阳, 何 冰, 武爱龙. 菠萝花果发育研究进展[J]. 中国南方果树, 2020, 49(6): 174-181.

ZHOU D, ZHANG X M, CHEN M, DU L Q, YAO Y L, WU J Y, HE B, WU A L. Research progress of pineapple flower and fruit development[J]. South China Fruits, 2020, 49(6): 174-181. (in Chinese)

[10] SRI T, GUPTA B, TYAGI S, SINGH A. Homeologs of Brassica, a central regulator of flowering time, are differentially regulated due to partitioning of evolutionarily conserved transcription factor binding sites in promoters[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2020, 147: 106777.

[11] LEE J, LEE I. Regulation and function of, a flowering pathway integrator[J]. Journal of Experimental Botany, 2010, 61(9): 2247-2254.

[12] DUAN X, LIANG J, WANG P. Overexpression of-like gene promotes flowering and decreases seed Set in Brachypodium[J]. International Journal of Agriculture and Biology, 2019, 22(2): 234-242.

[13] LIU Z, WU X, CHENG M, XIE Z H, XIONG C L, ZHANG S L, WU J Y, WANG P. Identification and functional characterization of-like genes in[J]. Genomics, 2020, 112(2): 1622-1632.

[14] SONG G Q, WALWORTH A, ZHAO D Y, HILDEBRANDT B, LEASIA M. Constitutive expression of the K-domain of a()gene is sufficient to promote flowering in tobacco[J]. Plant Cell Reports, 2013, 32(11): 1819-1826.

[15] 樊松乐, 王纪坤, 覃 碧, 王立丰. 植物转录因子研究方法及应用[J]. 分子植物育种, 2019, 17(15): 5003-5009.

FAN S L, WANG J K, QIN B, WANG L F. Analytic methods and application of plant transcription factors[J].Molecular Plant Breeding, 2019, 17(15): 5003-5009. (in Chinese)

[16] 史学英. 小麦脱水素基因启动子互作蛋白的筛选及鉴定[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2018.

SHI X Y, The Screeningand identification of proteins interacting with the promoter ofgene in wheat dehydrin[D]. Yangling: Northwest A & F University, 2018. (in Chinese)

[17] 罗 莹. 杨树SPR1互作蛋白的鉴定及功能初探[D]. 北京: 北京林业大学, 2020.

LUO Y. Identification and function exploration of SPR1 interaction proteins in poplar[D]. Beijing: Beijing Forestry University, 2020. (in Chinese)

[18] GAN Z, YUAN X, SHAN N, WAN C P, XU Y H, XU Q, CHEN J Y.mediates ethylene biosynthesis during postharvest ripening in kiwifruit[J]. Plant Science, 2021, 309: 110948.

[19] 李 慧. 罗田甜柿（Thunb）酵母杂交cDNA文库构建及启动子文库筛选[D]. 武汉: 华中农业大学, 2016.

LI H. Construction of yeast hybrid cDNA library and library sreening bypromoter in Luotian Tianshi Persimmon (Thunb.)[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2016. (in Chinese)

[20] YANG H J, ZHOU Y, ZHANG Y N, WANG J, SHI H Z. Identification of transcription factors of nitrate reductase gene promoters andcis-element through yeast one-hybrid screening in[J]. BMC Plant Biology, 2019, 19(1): 145.

[21] 秦琳琳, 张 曦, 姜 骋, 李 莉. 白桦基因启动子克隆和逆境响应元件功能分析[J]. 植物研究, 2019, 39(6): 917-926.

QIN L L, ZHANG X, JIANG C, LI L. Cloning and functional analysis ofpromoter from birch ()[J]. Bulletin of Botanical Research, 2019, 39(6): 917-926. (in Chinese)

[22] 王 典. 红麻叶片全长cDNA文库的构建及ESTs分析[D]. 福州: 福建农林大学, 2013.

WANG D. Construction of kenaf leaves full-length cDNA library and ESTs analysis[D]. Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University, 2013. (in Chinese)

[23] 杨成君, 王 军, 刘关君, 王英平. 红果人参叶中cDNA文库的构建[J]. 植物生理学报, 2007(4): 664-668.

YANG C J, WANG J, LIU G J, WANG Y P. Construction of cDNA library fromC. A. Mey. cv. Hongguo leaves[J]. Plant Physiology Journal, 2007(4): 664-668. (in Chinese)

[24] QI Y, LIU C, SUN X, QIU L, SHEN J. The identification of transcriptional regulation related gene of laccase poxc through yeast one-hybrid screening from[J]. Fungal Biology, 2017, 121(11): 905-910.

[25] LI R, ZHU F, DUAN D. Function analysis and stress-mediatedcis-element identification in the promoter region of[J]. Plant Signaling & Behavior, 2020, 15: 17736647.

[26] ZHANG X F, GAO M X, WANG S S, CHEN F, CUI D Q. Allelic variation at the vernalization and photoperiod sensitivity loci in Chinese winter wheat cultivars (vum L.)[J]. Frontiers in Plant Science, 2015, 6: 470.

[27] 鲜登宇, 江 为, 赵夏云, 汤青林, 宋 明, 王志敏. 开花整合子花期调控的分子机制[J]. 中国蔬菜, 2013(6): 1-8.

XIAN D Y, JIANG W, ZHAO X Y, TANG Q L, SONG M, WANG Z M.Molecular mechanism of flowering time control by flowering integration[J]. China Vegetables, 2013(6): 1-8. (in Chinese)

[28] KIM D. Epigenetic repression and resetting of a floral repressor,, in the life cycle of winter-annual[J]. Plant Biotechnology Reports, 2021, 16: 133-143.

[29] FEDORENKO O M, TOPCHIEVA L V, ZARETSKAYA M V, LEBEDEVA O N. Changes inandexpression during vernalization ofplants from northern natural populations[J]. Russian Journal of Genetics, 2019, 55(7): 865-871.

[30] KIM D, SUNG S. The binding specificity of the PHD-finger domain ofmoderates vernalization response[J]. Plant Physiology, 2017, 173(2): 1258-1268.

[31] TAO Z, SHEN L S, LIU C, LUC L, YAN Y Y, YU H. Genome-wide identification ofandtargets during the floral transition in[J]. Plant Journal, 2012, 70(4): 549-561.

[32] TANG X L, LIANG M X, HAN J J, CHENG J S, ZHANG H X, LIU X H. Ectopic expression of, a-domain transcription factor from lily, leads to delayed flowering in transgenic[J]. Plant Cell Reports, 2020, 39(2): 289-298.

[33] LI Y S, ZHOU Y Z, YANG W R, CHENG T R, WANG J, ZHANG Q X. Isolation and functional characterization of-like genes in[J]. Scientia Horticulturae, 2017, 215: 91-101.

[34] 杨修勤, 王志敏, 汤青林, 宋 明. 抽薹开花调控基因的作用机制[J]. 中国蔬菜, 2013(2): 4-11.

YANG X Q, WANG Z M, TANG Q L, SONG M. Effect mechanism ofgene regulation on bolting and flowering[J]. China Vegetables, 2013(2): 4-11. (in Chinese)

[35] LI C C, GU H Y, JIANG W, ZOU C H, WEI D Y, WANG Z M, TANG Q L. Protein interactions ofwithare regulated by a few crucial amino acids in flowering pathways of[J]. Acta Physiologiae Plantarum, 2019, 41(4): 43.

[36] 陈 娇, 赵夏云, 鲜登宇, 马关鹏, 谢 婷, 王志敏, 宋 明, 汤青林. 芥菜开花整合子启动子的克隆及其与FLCSVP蛋白互作的研究[J]. 园艺学报, 2015, 42(10): 1931-1943.

CHEN J, ZHAO X Y, XIAN D Y, MA G P, XIE T, WANG Z M, SONG M, TANG Q L. Promoter isolation of flowering signal integratorgene and its interactions with FLC and SVP proteins in[J]. Acta Horticulturae Sinica, 2015, 42 (10): 1931-1943. (in Chinese)

[37] LEE E, KIM T W, KIM J A, KIM H. Spontaneous retinal venous pulsation in unilateral primary open-angle glaucoma with low intraocular pressure[J]. Journal of Glaucoma, 2017, 26(10): 896-901.

[38] 李玉静, 陈 哲, 胡福初, 阮城城, 罗志文, 王祥和, 范鸿雁, 张治礼. 菠萝基因对乙烯利刺激的响应[J]. 热带作物学报, 2021, 42(10): 2806-2812.

LI Y J, CHEN Z, HU F C, RUAN C C, LUO Z W, WANG X H, FAN H Y, ZHANG Z L. Responses of pineapplegenes to ethephon stimulation[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2021, 42(10): 2806-2812. (in Chinese)

Screening of the PotentialRegulators in Pineapple

JIN Shunda1,2, HU Fuchu2, WANG Xianghe2, LI Yujing2, FAN Hongyan2, LUO Zhiwen2, ZHANG Zhili2*, CHEN Zhe2*

1. Institute of Horticulture, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China; 2. Institute of Tropical Fruit Trees, Hainan Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Tropical Fruit Tree Biology of Hainan Province / Investigation Station of Tropical Fruit Trees, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Haikou, Hainan 571100, China

Pineapple () is one of the main crops grown in the tropics in China, and the application of ethphon often promotes its flowering. However, the molecular mechanism of ethylene-induced pineapple flower formation and the five known flower formation pathways in plants. The relationship between them is unclear.() is a flowering integrator that can integrate various flowering signals to induce plant flowering. Experimental data showed that the() gene responded to ethylene induction, and the expression ofincreased after ethylene treatment of pineapple. To further understand the role ofin pineapple flower formation and the relationship between ethylene-induced pineapple flower formation and five major flower formation pathways, this study used ethylene-sensitive cultivar ‘Tainong No. 4’ as material, cloned thepromoter, and constructed pAbAi-pAcSOC1. The bait vector, using yeast single-hybrid technology, screenedcandidate regulators and verified it with dual luciferase experiments. The results showed that 4 candidate transcriptional regulators ofwere screened:(),(),(),(), and only,interacted with pAcSOC1.is a flowering inhibitor, and ethylene can inhibit the expression of thegene in pineapple. Therefore, it is inferred that ethylene-induced pineapple flower formation may be achieved by inhibiting thegene. That is, ethylene reduces the inhibitory effect ofon the expression ofby inhibiting the expression of, and the presentation ofis enhanced, which accelerates the process of ethylene-induced flower formation.

pineapple; ethylene induction; flowering regulation;regulatory factor

S668.3

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.10.002

2022-02-28；

2022-03-17

国家自然科学基金项目（No. 31960589）；海南省重大科技计划项目（No. ZDKJ2021014）。

金顺达（1996—），男，硕士研究生，研究方向：植物分子生物学。*通信作者（Corresponding author）：张治礼（ZHANG Zhili），E-mail：zzl_haas@163.com；陈 哲（CHEN Zhe），E-mail：214032886@qq.com。