2020年儿童流感嗜血杆菌临床株耐药性多中心研究

贾艳会 华春珍,* 周明明 俞惠 付盼 王传清 许红梅 景春梅 邓继岿 陈运生 张婷 张泓 林爱伟 王世富 曹清 周云芳 邓慧玲 曹三成 赫建华 高巍

(1 浙江大学医学院儿童医院，国家儿童健康临床研究中心，杭州 310003；2 复旦大学儿童医院，上海 201102；3 重庆医科大学儿童医院，重庆 400014；4 深圳市儿童医院，深圳 518026；5 上海交通大学儿童医院，上海 200040；6 山东大学齐鲁儿童医院，济南 250022；7 上海儿童医学中心，上海 200127；8 西安市儿童医院，西安 710002；9 开封市儿童医院，开封 475099)

流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae，Hi)是一种革兰阴性小球杆菌，主要分为有荚膜和无荚膜菌株两类。大部分的流感嗜血杆菌为机会性致病菌，也是临床中儿童最常分离到的条件致病菌之一[1-2]，该菌主要引起儿童呼吸道疾病，如社区获得性肺炎[2-4]、急性中耳炎、鼻窦炎[2,5]等。该菌在青春前期女童细菌性阴道炎中也是主要的致病菌之 一[6]。严重感染可侵入血流引起脓毒血症、脑膜炎等侵袭性感染[2,4,7]。多年来，治疗Hi感染的首选药物是氨苄西林，但是不同国家和地区，Hi对氨苄西林的耐药率差别较大[8-9]，且耐药率逐年上升趋势明显[8-10]。2016年以来，我国儿科细菌感染性疾病监测协作组(Infectious Disease Surveillance of Pediatrics，ISPED)对不同地域9家儿童医院的Hi进行耐药性监测[11-12]，发现Hi菌株对氨苄西林的耐药率从2016年的58.1%升至2019年的72.1%%，对氨苄西林舒巴坦的耐药率也从17.6%上升至43.0%，临床Hi疾病的治疗面临挑战。新冠疫情之后，在严格的防控策略下，儿童各种感染性疾病的发生率有明显下降，疫情后ISPED关于儿童来源的Hi尚未报道，现将2020年我国9家儿童医院的Hi耐药模式进行分析。

1 材料与方法

1.1 菌株来源和鉴定

我国不同地域的9家儿童医院组成ISPED协作组，成员单位包括浙江大学医学院附属儿童医院、重庆医科大学附属儿童医院、复旦大学附属儿科医院、上海交通大学医学院附属儿童医院、上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心、深圳儿童医院、西安儿童医院、山东大学齐鲁儿童医院、河南省开封市儿童医院。Hi临床株为2020年1月至12月鉴定者，且在嗜血杆菌选择性培养基上经分区划种半定量达“++”以上。细菌培养和鉴定方法按照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)当年指南执行。

1.2 β-内酰胺酶检测和药敏试验

按照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)2020版指南，采用头孢硝噻酚纸片(BioMériex,France)法检测β-内酰胺酶，采用MIC法(重庆儿童医院和复旦大学儿科医院)或Kirby-Bauer法(其他家儿童医院)进行药敏试验。MIC法使用奈瑟菌/嗜血杆菌检测试剂盒(重庆圣和源科技有限公司)；Kirby-Bauer法检测的抗生素包括氨苄西林(10 μg)、氨苄西林/舒巴坦(10 μg/10 μg)、头孢呋辛(30 μg)、头孢噻肟(30 μg)、美罗培南(10 μg)、氯霉素(30 μg)、复方磺胺甲恶唑(1.25/23.75 μg)、左氧氟沙星(5 μg)和阿奇霉素(15 μg)，均购自英国Oxoid公司。流感嗜血杆菌 ATCC49247为质控菌株贯穿始终，结果完全合格。

1.3 统计学方法

计数资料用n(%)表示，组间耐药率比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 标本来源及分布

共分离到Hi 2244株，其中来自呼吸道标本2104株(93.4%)，非呼吸道标本140株(6.23%)。1312株(58.5%)来自男性，患儿的年龄范围为10 d～16岁，中位数年龄0.92岁。菌株季节性分布显示1～6月份共1146株，占51%，其中以1月份构成比最高，共791株，占35.2%。具体标本分布见表1。

表1 标本类型菌株分布及构成比[n(%)]Tab.1 Specimen type distribution and composition ratio[n(%)]

2.2 β-内酰胺酶检测和药敏试验结果

2020年9 家医院2244株Hi对9种抗生素的耐药情况见表2。β-内酰胺酶阳性株和阴性株对9种抗生素的耐药率比较见表3。呼吸道来源Hi菌株对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦钠、头孢呋辛、复方磺胺甲恶唑和阿奇霉素的耐药率高于非呼吸道来源菌株(P＜0.01)，见表4。2244株Hi中，β-内酰胺酶阳性1451例，占64.6%。β-内酰胺酶阳性且氨苄西林舒巴坦耐药536株，占23.9%。其中175株(7.7%)为β-内酰胺酶阴性氨苄西林耐药Hi(β-lactamase negative and ampicillin-resistant，BLNAR)，BLNAR菌株和β-内酰胺酶阳性株对9种抗生素的耐药率比较见表5。

表2 2020年9家儿童医院分离的2244株流感嗜血杆菌对9种抗生素耐药情况Tab.2 Resistance of antibiotics against 2244 strains of H.influenzaeisolated from patients in 9 children's hospitals in 2020

表3 β-内酰胺酶阳性株和阴性株对9种抗生素的耐药率比较Tab.3 Comparison of resistance rate of 9 antibiotics against Haemophilus influenzae between β-lactamase positive isolates and negative isolates

表4 呼吸道来源与非呼吸道来源的Hi菌株对9种抗生素耐药率比较Tab.4 Comparison of resistance rates of 9 antibiotics against Haemophilus influenzae isolated from respiratory specimens and from non-respiratory specimens

表5 BLNAR菌株和β-内酰胺酶阳性株对9种抗生素的耐药率比较Tab.5 Comparison of resistance rates of 9 antibiotics against Haemophilus influenzae isolated between BLNAR and β-lactamase positive isolates

2.3 多重耐药情况

所有菌株中耐3种及3种以上不同种类抗生素的多重耐药菌株1293株，占57.6%。其中β-内酰胺酶阳性株和阴性株的多重耐药率比较，差异有统计学意义(P＜0.001)，见表6。呼吸道来源和非呼吸道来源的Hi株多重耐药率比较，差异有统计学意义(P＜0.001)，见表7。最常见的耐药模式为耐氨苄西林、复方磺胺甲恶唑和阿奇霉素，共735株(56.8%)。同时耐氨苄西林、氯霉素、复方磺胺甲恶唑和阿奇霉素共11株，占多重耐药株0.9%(11/1293)，同时耐氨苄西林、复方磺胺甲恶唑、阿奇霉素和左氧氟沙星共1株，占0.07%。

表6 β-内酰胺酶阳性株和阴性株的多重耐药率比较Tab.6 Comparison of multidrug resistance rates between β-lactamase positive isolates and negative isolates

表7 呼吸道来源和非呼吸道来源的Hi株多重耐药率比较Tab.7 Comparison of multidrug resistance rates against Haemophilus influenzae isolated from respiratory specimens and from non- respiratory specimens

3 讨论

本组Hi的主要标本来源为下呼吸道感染患儿的痰液标本，与该菌是儿童社区获得性肺炎最常见的细菌学病原吻合[3]。此外，3.47%的菌株来自有症状的阴道炎患儿的阴道拭子，提示该菌亦应是青春前期女童外阴阴道感染的常见病原菌[6]，与Wang等[11]2016年的研究数据一致。本组侵袭性菌株少见，仅血流来源12株和脑脊液来源6株，提示该菌引起化脓性脑膜炎侵袭性感染的少见[5,13]，可能与Hi临床株以无荚膜型为主，菌株侵袭力相对较弱有关。儿童Hi感染往往有明显的季节性，不同地区或同一地区的不同年份，因气候条件存在差异，该菌感染的高峰季节可能存在一定变迁，本组分离到Hi以1～6月份最多，与既往我国该菌的季节分布基本一致[11-12]。

10年前，日本和韩国的Hi对氨苄西林的耐药程度远较中国严重，但之后他们的菌株对氨苄西林的耐药率上升幅度并不大，多在70%以内[9-10,14-15]，而本组耐药性分析显示，2020年的Hi菌株对氨苄西林的耐药率已达72.1%，较2016年报道的58.1%有较大幅度上升[11]，值得高度关注，至于是否与耐药克隆在地区克隆播散密切有关，有待对菌株进行遗传背景研究再明确。Hi对氨苄西林耐药的机制有2种，分别是产生β-内酰胺酶破坏抗生素和青霉素结合蛋白3(PBP3)突变导致与氨苄西林等β-内酰胺类抗生素亲和力下降(即BLNAR机制)，其中产生β-内酰胺酶是我国Hi耐氨苄西林的主要机制[6,11-12]，而在本次研究中，β-内酰胺酶阴性耐氨苄西林的菌株占7.7%，较吕志勇等[16]在2015—2019年对Hi耐药性分析中β-内酰胺酶阴性耐氨苄西林的菌株3%有大幅提升，提示BLNAR耐药机制已不容忽视。此外，本研究发现β-内酰胺酶阳性菌株对其他抗菌药物的耐药率、多重耐药率也显著高于β-内酰胺酶阴性菌株，其原因可能与流感嗜血杆菌产β-内酰胺酶的主要机制和对复方磺胺甲恶唑、氯霉素耐药的机制均由质粒介导，这些耐药基因可整合在同一质粒接合子上,从而导致联合耐药[17-18]。BLNAR因PBP突变，菌株对氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸耐药。但本组中β-内酰胺酶阳性的菌株中也有23.9%的对含酶抑制剂的复合制剂不敏感，这些产酶菌株耐氨苄西林/舒巴坦的机制，是否同时存在fts基因突变导致其编码的PBP3的氨基酸序列改变所致，值得进一步研究。

本研究Hi菌株对氨苄西林的耐药率较国内外以往研究结果均明显升高，氨苄西林不再适用于首选临床经验治疗用药，但本研究Hi对氨苄西林/舒巴坦敏感率为65%，较氨苄西林、头孢呋辛、复方磺胺甲恶唑、阿奇霉素敏感率高，且β-内酰胺酶阳性且氨苄西林舒巴坦耐药占23.9%，氨苄西林舒巴坦仍是可以选择的药物之一。Hi对第三代头孢菌素头孢噻肟和头孢曲松敏感率高，对美罗培南的耐药率仅为0.6%，与我国新型冠状病毒肺炎流行前的研究数据大致一致[6,11-12]，提示对于儿童Hi感染，头孢噻肟或头孢曲松可作为首选用药。而对于严重感染或者威胁生命的侵袭性Hi感染，可考虑使用美罗培南等碳氢霉烯类抗生素[19]。

Hi也可引起泌尿、生殖道感染，同一地区的同一人群中，Hi耐药模式可因感染部位不同而存在较大差异。日本Deguchi等[20]比较呼吸道来源和泌尿道来源的Hi发现，呼吸道来源的Hi中BLNAR株构成比明显高于泌尿道菌株，而BLNAR正是日本Hi耐氨苄西林的主要机制。本研究组既往也曾对儿童呼吸道来源和阴道来源的Hi作过耐药性比较，发现呼吸道菌株对氨苄西林、头孢呋辛、克拉霉素、甲氧苄啶-磺胺甲基恶唑的耐药率显著高于阴道菌株[6]，与本多中心研究结果高度一致，提示对于Hi的抗感染治疗，抗生素的选择因感染部位不同而异。

Hi是一种条件致病菌，常寄居于人的上呼吸道，当前社区及医院对于儿童呼吸道感染在无细菌培养、无药敏指导下抗生素应用普遍广泛，可能导致高度耐药的定植Hi，本研究大多数菌株非无菌标本，所以不能排除定植菌来源，且本次研究侵袭性菌株少见，仅18株，其中氨苄西林耐药率为55%(10/18)，王高良等[21]研究儿童侵袭性Hi感染提示其氨苄西林耐药率为48%，可见侵袭株耐药率反而低。

本研究的局限是，大多数菌株为非无菌标本来源，不能排除定植菌来源，Hi是否为引起患儿感染的病原需结合临床分析；另外未能对分离到的Hi菌株进行血清分型。随着Hib疫苗的广泛接种，nontypableHaemophilus influenzae(NTHi)成为全球Hi疾病常见的菌型[22]。NTHi产生β-内酰酶的几率高于有荚膜的菌型，同时开展耐药性监测、耐药机制和血清分型研究是研究者今后努力的方向。