新版血站技术操作规程离心法制备的冷沉淀凝血因子FⅧ和血浆纤维蛋白原含量分析

黄华霖 刘伟平 冯叶 陈菊芬 彭及良

目前在临床上，为避免造成血液资源的浪费和减少输血反应，奉行患者“缺什么，输什么”的原则［1］。因此，血站工作人员将采集到的全血经离心、分浆、速冻、融化、病毒灭活等一系列措施制备成各种血液制品（血小板、血浆、冷沉淀等）［1］。冷沉淀属于血浆衍生物，是新鲜冰冻血浆在低温条件下融化生成的白色沉淀物［2］。目前常通过采用特定的提取方法制成，即将新鲜冰冻血浆（fresh frozen plasma，FFP）在（4±2）℃封闭状态融化后，进一步分离出沉淀在血浆中的冷不溶解物质，并在1 h 内冻结而制成的成分血［3］。冷沉淀在自采血之日起于-18℃以下可保存1年，37℃水浴融化后即可输注。冷沉淀凝血因子里主要含有凝血因子Ⅷ（Coagulation factor Ⅷ，FⅧ）、血管性血友病因子（von Willebrand factor，VwF）、纤维蛋白原（Fibrinogen，Fib）等［4］。临床上冷沉淀凝血因子主要用于Ⅷ因子、Ⅻ因子、纤维蛋白原缺乏症和血友病等凝血功能障碍性的疾病，同时，其在治疗创伤、烧伤和严重感染还有术后出血方面，具有良好的疗效［5-6］。

新版《血站技术操作规程》（2019 版）规定，离心法制备冷沉淀凝血因子的容量为40～50 mL，与《血站技术操作规程》（2015 版）的20～30 mL 比较，提高了冷沉淀凝血因子的制备容量［7］。在临床上，冷沉淀凝血因子特别适用于难以输注大量FFP 来提供充足的凝血因子的患者，以防止患者发生循环超负荷［8］。冷沉淀凝血因子的容量影响患者的输注疗效。新版血站技术操作规程大幅提高了离心法制备冷沉淀凝血因子的容量，因此，值得探讨容量改变是否会对FⅧ和Fib 含量产生影响，但目前相关研究较少。因此，本研究采用改良离心法（压沉法）与常规离心法（常规漂浮法）制备冷沉淀凝血因子，比较通过不同方法制备的冷沉淀凝血因子的FⅧ含量、Fib 含量和合格率。报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 样本来源

随机抽取40（人）份于2020年11月至2020年12月在深圳市龙岗区中心血站无偿献血者符合《献血者健康检查要求》的全血（400 mL/份），并将采集的血样采用CPDA-1 抗凝，储存于4℃环境，将其均分装成为200 mL 全血，并于采血后17～18 h分离制备成原料血浆（Raw Plasma，RP）100 mL/袋。随后进行标记区分：压沉法（对照组）和常规漂浮法（实验组），于-50℃血浆速冻机速冻成FFP，低于-20℃环境储存。

1.1.2 献血者资料

40 名无偿献血者年龄介于20～58 岁，平均年龄（37.80±8.92）岁，其中男性37 名、女性3 名；18 名受试者为初次献血，其余22 名受试者献血次数均超过2 次。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 试剂

全自动凝血分析仪（STAGO-STA Compact）配套检测试剂盒：FⅧ（希森美康有限公司，批号：256488）；Fib（希森美康有限公司，批号：255701）、纤维蛋白原检测试剂盒（希森美康有限公司，批号547031）。

1.2.2 仪器

4℃血液储存箱（日本SANYO 公司）；大容量低温离心机（德国Thermo 公司）；全自动血液成分分离机（德国LMB 公司）；多美达血浆速冻机（卢森堡Dometic 公司）；水浴式低温融化箱（美国Polyscience 公司）；医用低温箱（日本SANYO 公司）；电热恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司）；全自动凝血分析仪（法国STAGO 公司）。

1.3 方法

1.3.1 冷沉淀凝血因子制备

对照组：根据《血站技术操作规程》（2015 版）［9］，将对照组40 袋制备的FFP 放入改良水浴式低温融化箱融化，至基本融化时，取出于2～6℃以离心半径31.6 cm、转速3 800 r/min 离心10 min，将每袋的冷上清转移至1 个新的100 mL 空袋中，袋底剩余的20～30 mL 血浆与冷不溶解物质混合即为冷沉淀凝血因子，并在1 h 内置于-50℃血浆速冻机速冻。

实验组：根据《血站技术操作规程》（2019版）［10］，将对照组40 袋FFP 置于4±2℃水浴式低温融化箱中，至基本融化时，取出于2～6℃以离心半径31.6 cm、转速3 800 r/min 离心10 min，将每袋的冷上清转移至1 个新的100 mL 空袋中，袋底剩余的40～50 mL 血浆与冷不溶解物质混合即为冷沉淀凝血因子，并在1 h 内置于-50℃血浆速冻机速冻。

两组制备好的冷沉淀凝血因子均储存于-20℃冰箱待用。

1.3.2 FⅧ与Fib 含量测定

取同一无偿献血者以两组方法制备的冷沉淀凝血因子，同一时间置于电热恒温水槽中完全融化后充分混匀，各留取8 mL/份的标本并立即用全自动凝血分析仪进行FⅧ和Fib 含量测定。

1.4 冷沉淀凝血因子质量（合格）标准

根据《全血及成分血质量要求》GB18469-2012［11］，100 mL/袋的FFP 制备得到的冷沉淀凝血因子，FⅧ≥40 IU/袋、Fib≥75 mg/袋。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计软件对数据进行处理，计量数据以（）表示，采用t检验；计数数据以n（%表示，用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法制备的凝血因子中FⅧ和Fib 含量比较

实验组制备的凝血因子容量高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。对照组与实验组的FⅧ含量比较差异无统计学意义（P＞0.05）；实验组Fib 含量明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组凝血因子中FⅧ与Fib 含量比较（±s）Table 1 Comparison of Fⅷand Fib contents in coagulation factors of the two groups（±s）

表1 两组凝血因子中FⅧ与Fib 含量比较（±s）Table 1 Comparison of Fⅷand Fib contents in coagulation factors of the two groups（±s）

组别对照组实验组t 值P 值n 40 40容量（mL）28.91±0.41 46.53±1.21 85.640 0.000 FⅧ含量（IU/100 mL）70.55±21.16 67.00±20.09 2.923 0.066 Fib 含量（mg/100 mL）118.03±24.18 144.96±25.77 14.435 0.000

2.2 两种方法制备的冷沉淀凝血因合格率比较

两组的冷沉淀凝血因子FⅧ与Fib 合格率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 两组冷沉淀凝血因子合格率比较［n（%）］Table 2 Comparison of qualified rate of cryoprecipitate coagulation factor between the two groups［n（%）］

3 讨论

离心法制备冷沉淀首先要做的就是把原料新鲜冰冻血浆放在水浴箱中融化，调控水温使之维持在2～6℃，待血浆基本融化后，及时取出，离心［12］。因为冷沉淀对温度的要求比较高，所以离心机在离心前需要进行预温处理，保证产品的质量。离心后取出在低温料理台上用血液分浆夹把上层的大部分血浆分离出来，下层少量血浆和不易溶解的白色沉淀物即为冷沉淀。分离完成后在1 h内将冷沉淀速冻呈固态并置于-20℃以下的低温冰箱中保存备用，有效期从采血之日起为一年［13-14］。冷沉淀中含有凝血因子Ⅷ、血管性假血友病因子、纤维蛋白原、纤维结合蛋白，因子ⅩⅢ等，适用于儿童及成人轻型甲型血友病、血管性血友病、先天性或获得性纤维蛋白原缺乏症及因子XⅢ缺乏症病人，也用于手术后出血、严重外伤及早期弥漫性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）等病人的替代治疗［15］。目前采供血机构比较常用的冷沉淀凝血因子制备方法是虹吸法和离心法。离心法在4℃条件下重度离心，将解冻后的FFP 中的不溶物质沉淀到血袋底部，提高了冷沉淀凝血因子的制备回收率。FⅧ是冷沉淀凝血因子有效成分中不稳定的凝血因子，其含量的高低反映了制备方法的优劣。离心法制备冷沉淀凝血因子的关键因素包括FFP 融化时的温度和时间、冷沉淀凝血因子的容量等［16］。本站冷沉淀凝血因子制备采用离心法压沉法水浴方式融化FFP 制备冷沉淀凝血因子，该方法通过加1 个不锈钢网盖到水浴式低温融化箱，解决了其融化血浆时可能出现的部分血袋漂浮在水面上的问题，使FFP 融化温度精准控制在4±2℃，缩短融化时间，该方法制备的冷沉淀凝血因子容量明显高于常规离心法。但对照组与实验组的FⅧ含量差异无统计学意义，提示不同离心方法制得的冷沉淀凝血因子容量对FⅧ含量无影响。

此外，对照组的Fib 含量低于实验组，有统计学意义。欧洲输血委员会最新标准［17］指出，冷沉淀凝血因子的容量为30～40 mL，最大容量为40 mL；去冷沉淀冰冻血浆与FFP 比较，Fib 含量有所下降。而且相关文献研究显示，去冷沉淀冰冻血浆中Fib含量约为FFP 的31.8%（0.88 g/L：2.77 g/L）［18］。在冷沉淀凝血因子制备过程中，Fib 未能完全与FⅧ结合成冷不溶解物质，Fib 游离在冷上清中，当剩余容量减少时，Fib 相应减少。但两组的Fib 合格率一致，均为92.5%，符合国标要求［19］（75%的抽检结果落在质量控制指标范围内，可认为血液采集和制备过程受控）。Fib 是冷沉淀凝血因子有效成分中稳定的凝血因子，在Fib 不足的情况下，可以联合使用Fib 的纯化浓缩物，达到减少输血量的目的。

FFP 是不超过18 h 将血浆从全血中分离出并在1 h 内冻结而制成的成分血。本研究制备冷沉淀凝血因子所用的40 袋FFP，从全血采集到成分分离后速冻成FFP 时间控制在17～18 h，达到FFP 的最低质量要求。本研究通过比较改良离心法（压沉法）与常规离心法（常规漂浮法）制备冷沉淀凝血因子，探讨《血站技术操作规程》（2019 版）离心法制备冷沉淀凝血因子的FⅧ含量、Fib 含量和合格率。最终制备的冷沉淀FⅧ与Fib 合格率均符合要求，且Fib 含量高于《血站技术操作规程》（2015 版），值得将新版血站技术操作规程推广应用。

综上，本研究采用两种不同的方式制备冷沉淀凝血因子从而探讨《血站技术操作规程》（2019 版）离心法制备冷沉淀凝血因子容量改变的可行性。结果，根据新版《血站技术操作规程》（2019 版）制备的冷沉淀FⅧ与Fib 合格率均符合要求，且Fib 含量较高，建议采用新版血站技术操作规程制备冷沉淀。