骨髓CKS1B、p53基因表达对多发性骨髓瘤患者化疗效果及预后的评估价值

廖彩翔 黎国伟 秦晓铧

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一种浆细胞恶性增殖性疾病，多发于中老年人。近年来，随着靶向药及造血干细胞移植的应用，MM 患者预后明显改善，但因MM 为异质性极强的肿瘤，患者生存期从数月到数十年不等［1］。决定MM 患者预后异质性的主要因素为细胞遗传学异常，MM 患者最常见的结构异常为1 号染色体异常，其中45%MM 患者1q 扩增均涉及1q21［2］。1q21 包含一个CKSIB基因，为高度保守的细胞周期蛋白激酶亚基1 蛋白家族成员之一，该家族与细胞周期蛋白依赖激酶（CDKs）互相作用，影响细胞周期进程，因此可能在MM 发病机制中有一定应用价值［3］。p53基因最易发生异常，野生型p53 可诱导细胞凋亡，负性调节细胞周期［4］。但目前鲜有报道关于p53基因在MM 患者中的表达情况，而国内尚未见CKSIB在MM 患者中的作用。本研究通过分析MM 患者化疗后骨髓CKSIB、p53基因表达，旨在探讨其在MM 患者中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年6月至2022年3月收治于惠州市中心人民医院的86 例MM 患者作为研究对象。所有患者化疗4 个疗程（硼替佐米+地塞米松+来那度胺，28d 为1 个疗程）后根据2014 国际骨髓瘤工作组标准将86 例MM 患者分为有效组（n=53）和无效组（n=33）。其中男59 例，女27 例；平均年龄（68.15±4.57）岁；纳入标准：①符合国际骨髓瘤工作组诊断标准［5］；②有完整的临床资料及随访资料。排除标准：①患有其他血液系统疾病；②患有认知障碍患者。所有患者或家属均已签署知情同意书。本研究通过医院伦理委员会审核并批准。

1.2 疗效评估标准［5］

完全缓解（CR）：血清和尿液免疫固定电泳均为阴性，软组织浆细胞瘤消失，骨髓中浆细胞＜5%；部分缓解（PR）：M 蛋白减少≥50%，24 h 尿M蛋白减少≥90%或降至＜200 mg/24 h；骨髓内浆细胞数量减少≥50%；疾病稳定（SD）：血清M 蛋白减少≥50%；疾病进展（PD）：M 蛋白最低值≥5 g/dL，尿M 蛋白≥200 mg/24 h，骨髓浆细胞比例增加25%。

1.3 FISH 法检测骨髓CKS1B、p53 基因表达

浆细胞纯化：采用CD138 抗体MACS 分选浆细胞，详细步骤参考文献［6］，将分选的浆细胞用常规方法低渗，将染色体置-20℃条件下备用。

CKS1B/CDKN2C 所用试剂盒：安必平（LBP）1q21/1p32 基因探针，厂家：安必平；P53 所用试剂盒：慢性淋巴细胞白血病染色体及基因异常探针检测试剂盒TP53/CEP17 双色探针，厂家：康录生物。取出标本，用甲醇/冰醋酸（3∶1）固定液，然后气千法滴片，在37℃2×SSC 中老化30 min，分别在70%、85%、100%乙醇各脱水2 min。把标本用70%甲酰胺/2×SSC 变形3 min。每个标本滴加探针1 μL，用杂交稀释液4 μL 混合均匀，水浴（72℃）变性5 min。加探针5 μL 于带杂交区，盖玻片后杂交过夜。将玻片放入72℃0.4×SSC/0.3%吐温中2 min，2×SSC/0.1%吐温中1 min 后将玻片晾干。待15 min 后用荧光显微镜进行观察，具体探针阈值：1q21 扩增为5.5%、P53 缺失为6.0%。CKS1B（1q21）扩增、CDKN2C（1p32）缺失、TP53 的阳性截断值为20。每例MM标本分析≥100 个骨髓瘤细胞，计算阳性信号出现的百分率，超过截断值则判定为阳性［7］。

1.4 临床资料收集

收集所有患者的相关临床资料，包括年龄、性别、（Durie-Salmon，DS）分期、国际分期体系（International Staging System，ISS）分期、修正的国际分期体系（Revised-International Staging System，R-ISS）分期、血β2-微球蛋白、C 反应蛋白、血钙、乳酸脱氢酶、血红蛋白等。MM 患者疾病分期依据《血液病诊断及疗效标准》［8］中DS 分期、ISS 分期及R-ISS 分期标准进行评估。其中R-ISS 分期Ⅰ期：乳酸脱氢酶（LDH）水平正常和细胞遗传学标危患者；Ⅱ期：不符合R-ISS-Ⅰ期和Ⅲ期患者；Ⅲ期：符合R-ISS-Ⅲ期且为细胞遗传学高危或LDH 偏高患者。

1.5 随访

所有患者均通过电话或门诊复诊形式随访，患者疾病进展情况及生存状态，本研究中末次随访截止日期为2022年5月31日，无失访。随访时间至少3年，69 例疾病稳定，17 例疾病进展。

1.6 统计学方法

应用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析。计数资料以n（%）表示，用χ2检验；并以Cox风险比例模型分析骨髓CKS1B、p53表达与MM 患者预后的关系。以Kaplan-Meier法绘制生存曲线，并以Log-Rank法进行组间生存差异检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组骨髓CKS1B、p53 阳性表达率比较

有效组MM 患者骨髓CKS1B、p53阳性表达率显著低于无效组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组骨髓CKS1B、p53 阳性表达率比较［n（%）］Table 1 Comparison of positive expression rates of CKS1B and p53 in bone marrow between two groups［n（%）］

2.2 骨髓CKS1B、p53在MM患者疗效监测中的价值

绘制CKS1B、p53 对MM 患者疗效监测的ROC曲线分析显示，CKS1B、p53 的最佳截断值分别为0.78、0.51，AUC 分别为0.851、0.896，敏感度为75.75%、90.90%，特异度为77.35%、83.01%。见表2、图1。

表2 骨髓CKS1B、p53 在MM 患者疗效监测中的价值Table 2 The value of bone marrow CKS1B and p53 in curative effect monitoring of MM patients

2.3 骨髓CKS1B、p53 阳性表达与MM 患者临床特点的关系

MM 患者的骨髓CKS1B、p53 阳性表达与R-ISS 分期、C 反应蛋白、血红蛋白有关，差异有统计学意义（P＜0.05），而与年龄、性别、DS 分期、ISS分期、血β2-微球蛋白、血钙、乳酸脱氢酶无明显相关性（P＞0.05）。见表3。

表3 骨髓CKS1B、p53 阳性表达与患者临床特点的关系Table 3 The relationship between positive expression of CKS1B and p53 in bone marrow and clinical characteristics of patients

2.4 影响MM 患者预后的单因素分析

本研究MM 患者的3年生存率为80.23%（69/86）。单因素分析结果显示，白细胞、血红蛋白、血小板、乳酸脱氢酶、血β2-微球蛋白、CKS1B 及p53 是影响MM 患者预后的危险因素（P＜0.05）。见表4。

表4 影响MM 患者预后的单因素分析［n（%）］Table 4 Univariate analysis affecting the prognosis of MM patients［n（%）］

2.5 影响MM 患者预后的Cox 回归分析

以MM 患者预后为因变量进行Cox多因素回归分析，结果显示，白细胞、血红蛋白、CKS1B 及p53 为MM 患者预后不良的独立影响因素（P＜0.05），见表5。其中，CKS1B 阳性表达组（71.42%）3年生存率低于阴性表达组（90.90%），p53 阳性表达组（50.00%）3年生存率低于阴性表达组（82.00%），差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表5、图2。

表5 影响MM 患者预后的Cox 回归分析Table 5 Cox regression analysis affecting the prognosis of MM patients

图2 骨髓CKS1B、p53 表达与MM 患者3年生存率的相关性Figure 2 Correlation between the expression of CKS1B and p53 in bone marrow and the 3-year survival rate of MM patients

3 讨论

决定MM 患者预后异质性的主要因素为细胞遗传学异常。近年来，有研究显示CKS1B 基因位于染色体1q21，为SCFSkp2 泛素化复合体的主要成分，可降解大部分细胞周期调控因子，在多种肿瘤的发生及发展占重要作用［9］。CKS1B 在Skp2 与磷酸化的p27kip1 的结合中起促进作用，使p27kip1 泛素化和随后经蛋白酶体降解中有重要意义。p27kip1 与Cdk2/cyclin A 复合体结合并抑制细胞周期G1-s 期转换，所以其降低异常可引发细胞恶性增殖、细胞周期紊乱。

已有相关报道CKS1B 表达过高可导致肿瘤形成，此类患者预后较差［10］。p53 可诱导细胞周期紊乱或细胞凋亡，从而维持基因组的稳定。而肿瘤的特征之一即为基因组不稳定，因此p53 功能异常在肿瘤发生、发展中起重要作用。目前临床研究较多报道CKS1B、p53 在肿瘤发生发展中的应用，但关于CKS1B、p53 功能异常在MM 发生、发展的作用的研究较少。本研究结果表明CKS1B、p53 与MM 发病有关。两者阳性表达差异可反映化疗疗效，可作为MM 患者化疗后疗效评估的辅助指标。绘制CKS1B、p53 对MM 患者疗效监测的ROC 曲线分析显示，CKS1B、p53 的最佳截断值分别为0.78、0.51，AUC 分别为0.851、0.896，敏感度为75.75%、90.90%，特异度为77.35%、83.01%。提示骨髓CKS1B、p5 可能对MM 患者有一定的诊断价值。有研究发现［11］，miR-1258 可能通过靶向CKS1B 调控细胞增殖和迁移，提示CKS1B 是癌肿瘤治疗的潜在靶点。CKS1 高表达提示肿瘤预后较差和生活质量低下，p53 的高表达与众多疾病的预后相关，提示两者是疾病预后的影响因素。本研究发现MM 患者的骨髓CKS1B、p53 阳性表达与R-ISS 分期、C 反应蛋白、血红蛋白有关，差异有统计学意义，而与年龄、性别、DS 分期、ISS 分期、血β2-微球蛋白、血钙、乳酸脱氢酶无明显相关性。本研究MM 患者的3年生存率为80.23%（69/86）。与杨玉［12］、Li 等［13］的研究类似。白细胞、血红蛋白、CKS1B、p53 高表达可能是导致MM 患者生存期缩短的原因。Hao 等［14］的研究报道染色体1q21/CKS1B 的增加或扩增是骨髓瘤的高危因素，p53 基因缺失也被认为是MM 的高危特征。本研究进一步进行Cox多因素回归分析，结果显示，白细胞、血红蛋白、CKS1B 及p53 为MM 患者预后不良的独立影响因素，提示CKS1B 及p53 的异常表达对MM 预后带来不良影响，有可能成为病情监测与预后评估的重要指标之一。

综上，骨髓CKSIB、p53 对MM 患者疗效监测有一定价值，MM 中骨髓CKSIB、p53 阳性表达与白细胞、血红蛋白及预后密切相关。有望成为MM 疗效及预后评估的特异性指标，但本研究不足之处在于样本量较少，日后需加大样本量延长随访时间验证相关指标在MM 患者中所发挥的作用。