黄芪锌多糖的体内、体外抗氧化作用

刘 莹，迟 惠，刘 艳，于 妍*

（1.长春科技学院 生命科学学院，吉林长春 130600；2.吉林省药品检验研究院，吉林长春 130000）

锌是动物体内必需的微量元素，是动物体内多种酶的重要部分，与动物体内氨基酸、蛋白质、脂肪、碳水化合物和核酸代谢密切相关（袁心田等，2022）。种禽如果缺锌，将对种蛋孵化和鸡雏发育等造成严重影响。此外，锌元素是睾丸发育和精子形成过程中所必需的微量元素，种公禽缺锌将会导致其睾丸发育不良和精子形成障碍（高庆江和郝金法，2003）。而缺乏锌元素也会导致幼龄动物生长迟缓、发育不良、关节肿大及免疫功能下降（王金和，2017）。目前，在动物生产中多以无机锌的方式添加锌元素。无机锌不仅生物利用率低，摄入过量还会导致中毒。进一步的研究发现，与无机锌相比，有机锌不仅具有更高的生物利用率，还更安全（Yonekura和Suzuki，2003）。而锌多糖作为第三代补锌剂，能被人体更高效、更安全的利用，已成为目前的研究热点（赵姝雯等，2016；陈宏伟等，2009）。现如今，锌多糖的合成主要有化学合成法、微生物转化法和植物转化法（陈平等，2015）。

黄芪，最先记载于《神农本草经》，已有2000多年的用药历史。目前为止，已从黄芪中分离鉴定出多种生物活性大分子，包括皂苷、氨基酸、异黄酮和多糖等。黄芪多糖是黄芪中的重要大分子活性物质，主要分为杂多糖和葡聚糖。大量研究表明，黄芪多糖具有多种生物学功能，如抗氧化、抗炎、和免疫调节等（Yu等，2022；Auyeung等，2016），可提高动物生产性能和机体抗氧化能力。赵正伟等（2022）研究表明，在日粮中添加黄芪多糖可显著提高滩羊生长性能和血清抗氧化能力。黄芪多糖可降低仔猪腹泻率，提高仔猪生长性能、免疫功能和血清抗氧化功能（崔玉革和李玉青，2022）。当前，一系列研究表明，与多糖相比，锌多糖在抗氧化、抗炎、降血脂、抗肿瘤等功能上效果更好。江洁等（2018）研究表明，羊肚菌菌丝体锌多糖比羊肚菌菌丝体多糖具有更好的抗氧化活性。罗敏等（2017）以大米胚芽多糖和硫酸锌为原料制备大米胚芽锌多糖，结果表明，与大米胚芽多糖相比，大米胚芽锌多糖对DPPH自由基和羟基自由基的清除率更高，其抗氧化活性更强。目前，对黄芪锌多糖体内、体外抗氧化活性的研究尚未报道。因此，本试验用黄芪多糖与硫酸锌制备出黄芪锌多糖，并研究其体外抗氧化活性，旨在为开发具有不同新型多糖与锌元素螯合物的研究奠定理论基础，同时增加黄芪多糖的附加值。

1 材料与方法

1.1 试验材料、试剂与仪器试验选取3周龄雄性昆明种健康小鼠，体重（10～12）g，购于吉林省实验动物中心；黄芪饮片购买于吉林百草大药房；石油醚、苯酚、无水乙醇、氯仿、正丁醇、DPPH、VC等均为分析纯：北京化工厂。

Z-2000火焰原子吸收光谱仪：日本日立公司；BLHH-6N数显电热恒温水浴锅：上海森信仪器有限公司；Uvmini-1240紫外可见分光光度计：日本岛津公司；TS-2脱色摇床：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；SHA-B水浴恒温水浴锅器：常州市仪都仪器有限公司；TG-21WC高速离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 黄芪多糖的提取 黄芪多糖采用水提醇沉法进行提取，具体步骤：将1 kg黄芪饮片粉碎过60目筛，随后加入10倍体积石油醚脱脂4 h。将脱脂后的滤渣烘干，按料液比1∶10（g/mL）加入蒸馏水70℃提取2 h，提取3次；收集滤液，蒸发浓缩后加入3倍体积无水乙醇，4℃静置后产生沉淀。5000 r/min离心15 min。将沉淀物复溶后加入sevag试剂（正丁醇∶氯仿=1∶3）进行脱蛋白处理，反复多次，直至无明显残留。置50℃烘箱干燥即得黄芪粗多糖（APSd）。将黄芪粗多糖溶液缓慢滴加到经处理过的加样至DEAE-52纤 维 素 柱，用 蒸 馏 水、0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为5 mL/min，5 mL收集一管，蒽酮-硫酸法检测至无糖检出，合并主要吸收峰的洗脱液，氯化钠洗脱部分透析48 h除盐，浓缩冷冻干燥，得到纯化的黄芪多糖（APSp）。

1.2.2 多糖含量的测定 采用苯酚-硫酸法测定黄芪多糖中多糖含量，具体步骤参考罗敏等（2017）的方法进行。

1.2.3 黄芪锌多糖的制备 取1.0 g黄芪多糖溶于150 mL蒸馏水中配制成黄芪多糖溶液，随后缓慢加入0.8 g ZnSO4·7H2O 溶液，调节溶液pH至6.0，50℃水浴搅拌反应3 h。反应完毕后，70℃浓缩至原体积的1/3，随后冷却，加入4倍体积的乙醇进行沉淀，4℃静置24 h，4000 r/min，离心15 min得到沉淀，将沉淀用少量去离子水溶解后用蒸馏水透析24 h，乙醇醇析沉淀物，50℃真空干燥得黄芪锌多糖（锌APSp）。

1.2.4 锌多糖中锌含量的测定 使用火焰原子吸收分光光度计测定锌元素含量，具体步骤参考王艳等（2013）的方法进行。

1.2.5 体外抗氧化性试验 试验分别测定黄芪锌多糖·OH、O2-·和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由清除率，以VC为对照，具体试验步骤参考黄玲玲等（2015）的方法进行。

1.2.6 体内抗氧化性试验

1.2.6.1 动物饲养及样品采集 将40只4周龄健康昆明雄性小鼠随机分为4组，每组10只。空白组：上午腹腔注射生理盐水15 mL/（kg·d），下午灌胃生理盐水10 mL /（kg·d）；对照组：上午腹腔注射D-半乳糖100 mg/（kg·d），下午灌胃生理盐水10 mL/（kg·d）；黄芪多糖组：上午腹腔注射D-半乳糖100 mg/（kg·d），下午灌胃黄芪多糖200 mg/（kg·d）；黄芪锌多糖组：上午腹腔注射D-半乳糖100 mg/（kg·d），下午灌胃黄芪锌多糖200 mg/（kg·d），连续试验30 d。小鼠喂养条件：温度为20～24℃，相对湿度为55%～65%，循环光照12 h。试验结束时，各组小鼠处死前12 h禁食不禁水。各组小鼠按2.0 g/kg体重注射氨基甲酸乙酯进行麻醉，眶静脉窦取血至抗凝管中；抗凝管中的血液样品（4℃，3000 r/min，15 min），取血浆于-20℃保存。随后断颈处死小鼠，收集小鼠肝脏组织用于后续试验。

1.2.6.2 小鼠血清及肝脏抗氧化能力的测定 使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定小鼠血清及肝脏中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）活 性、总 抗 氧 化 能 力（Total antioxidant capability，T-AOC）、过氧化脂质（Lipid peroxide，LPO）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，具体试验步骤参考说明书进行。

1.3 数据统计所有试验数据以“平均值±标准差”表示，采用SPSS 22.0对数据进行单因素方差分析，采用Duncan’s法进行多重比较。使用GraphPad Prism软件制图，当P＜0.05表示组间差异显著。

2 结果与分析

2.1 黄芪多糖得率和糖含量由表1可知，去蛋白后的黄芪粗多糖（APSd）得率为（4.12±0.15）%，多糖含量为（56.15±2.38）%；经DEAE-52纤维素柱纯化后的黄芪多糖（APSp）得 率 为（2.01±0.13）%，多 糖 含 量 为（83.17±1.95）%。

表1 黄芪多糖的得率和糖含量 %

2.2 黄芪锌多糖的得率、糖含量和锌含量本试验制备黄芪锌多糖的条件是先前实验室优化的最适条件。由表2可知，锌化黄芪多糖 得率 为（34.46±2.05）%，其中 多 糖含 量 为（56.35±4.87）%，锌含量为（11.32±0.48）mg/g。

表2 黄芪锌多糖的得率、糖含量和锌含量

2.3 黄芪锌多糖体外抗氧化作用

2.3.1 黄芪锌多糖·OH清除率结果分析 由图1可知，随着APSp和锌APSp浓度的增加，对·OH自由基的清除率逐渐增加，表现出量效关系。当浓 度为2.0 mg/mL时，APSp和 锌APSp对·OH自由基的清除率分别为43.33%和50.47%，均低于VC，半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分别为0.16和0.13 mg/mL。当 浓 度 为0.7 mg/mL时，APSp和 锌APSp二 者对·OH自由基的清除率趋于平缓。VC对·OH自由基的清除率达84.92%，可见APSp和锌APSp二者的·OH清除率与VC差异较大。此外，结果表明，锌APSp清除·OH的活性比APSp提高16.45%。

图1 黄芪锌多糖对·OH清除率

2.3.2 黄芪锌多糖O2-·清除率结果分析 APSp和锌APSp对O2-·均有一定的清除作用。其清除能力与多糖质量浓度成正相关。当多糖浓度为2.0 mg/mL时，APSp和锌APSp对O2-·的清除率分别为37.91%和48.83%，二者IC50分别为0.17和0.19 mg/mL，均低于VC。当VC浓度为2.0 mg/mL时，VC对O2-·的清除率为91.13%。对O2-·清除作用大小为VC＞锌APSp＞APSp。此外，试验结果表明，锌APSp清除O2-·的活性比APSp提高28.80%。

图2 黄芪锌多糖对O2-·清除率

2.3.3 黄芪锌多糖DPPH自由基清除率结果分析 由 图3可 知，APSp和 锌APSp对DPPH自由基的清除率随浓度增加逐渐增加。当多糖浓度 为2.0 mg/mL时，APSp和 锌APSp对DPPH自由基的清除率分别为56.36%和72.72%，二者IC50分别为0.16和0.13 mg/mL。当多糖浓度为1.0 mg/mL时，APSp和锌APSp二者对DPPH自由基的清除率趋于平缓。对DPPH清除作用大小为VC＞锌APSp＞APSp。此外，试验结果表明，锌APSp清除DPPH的活性比APSp提高26.15%。

图3 黄芪锌多糖对DPPH自由基的清除率

2.4 黄芪锌多糖体内抗氧化作用

2.4.1 黄芪锌多糖对小鼠血清抗氧化功能的影响 由表3可知，APSp组和锌APSp组小鼠血清中SOD、CAT和T-AOC活性显著高于对照组（P＜0.05），MDA和LPO水平显著低于对照组（P＜0.05）。此外，APSp组和锌APSp组小鼠血清中SOD、MDA、T-AOC和LPO水平具有显著差异，锌APSp组小鼠血清中SOD和T-AOC活性显著高于APSp组（P＜0.05），MDA和LPO水平显著低于APSp组（P＜0.05）。

表3 黄芪锌多糖对小鼠血清抗氧化功能的影响

2.4.2 黄芪锌多糖对小鼠肝脏抗氧化功能的影响 由表4可知，APSp组和锌APSp组小鼠肝脏中SOD、CAT和T-AOC活性显著高于对照组（P＜0.05），MDA和LPO水平显著低于对照组（P＜0.05）。此外，与APSp组相比，锌APSp组小鼠肝脏中SOD、CAT和T-AOC活性显著升 高（P＜0.05），MDA和LPO水 平 显 著 降 低（P＜0.05）。

表4 黄芪锌多糖对小鼠肝脏抗氧化功能的影响

3 讨论

黄芪多糖因其良好的抗氧化活性，提高机体免疫力和抗肿瘤等功能已成为当前的研究热点。此外，锌作为体内重要的微量元素，在体内蛋白质和DNA合成、细胞生长、增殖、代谢调控等生理过程中起重要作用（黄玲玲等，2015）。通过化学合成的方式将黄芪多糖与无机锌合成黄芪锌多糖不仅可以提高黄芪多糖的抗氧化活性等功能，还可提高机体对无机锌的利用。在本试验中，按照实验室先前的优化条件利用黄芪多糖和硫酸锌制备出黄芪锌多糖，通过测定得出所获得的黄芪锌多糖锌元素含量为11.32 mg/g，多糖含量为56.35%。

体外自由基清除能力是评价抗氧化物质活性 的 重 要 指 标（Duan等，2021；Samavati等，2013）。本研究运用体外抗氧化试验对黄芪锌多糖的·OH、O2-·和DPPH自由基清除能力进行分析。试验结果表明，与黄芪多糖相比，黄芪锌多糖具有更强的体外抗氧化能力，其对·OH、·和DPPH自由基清除能率更高。研究表明，通过将多糖与锌进行螯合获得锌多糖后，其锌多糖的基本骨架没有改变，只有部分羟基和羰基发生改变，锌多糖维持了多糖的活性结构（Dong等，2018）。先前的研究表明，锌多糖相比于多糖具有更高的抗氧化活性。与罗尔阿太菌相比，罗耳阿太菌锌多糖的体内外抗氧化活性更高（董金满，2018）。罗敏等（2013）研究证实，大米胚芽多糖锌化后，其对·OH、O2-·和DPPH自由基的清除能力更强。Zheng等（2020）研究结果也表明，光帽鳞伞菌丝体锌多糖的体外抗氧化能力较光帽鳞伞菌丝体多糖更高。上述研究结果与本研究结果一致，通过对多糖进行锌化后，其体外抗氧化能力会得到提高。

抗氧化指标与动物机体健康程度、体内代谢、外界环境变化及机体免疫能力密切相关。SOD和CAT是体内重要的抗氧化应激酶，是体内重要的抗氧化应激指标。T-AOC水平反映了机体抵抗自由基伤害的非酶促防御能力（Jin等，2012）。此外，脂质过氧化反应的产物LPO具有一定的毒性，可以影响细胞膜的流动性和细胞代谢，进而导致细胞损伤和凋亡。因此，LPO的含量作为组织损伤的一项指标，被广泛应用于抗氧化研究。而MDA是机体脂质过氧化反应产物，会引起体内蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，可反映细胞受损伤程度及脂质过氧化程度（计莉强等，2017）。当机体受到氧化应激影响时，其体内抗氧化系统失衡，自由基水平升高，体内SOD、CAT和T-AOC水平显著降低，MDA和LPO水平显著升高。在本试验中，对照组小鼠受到D-半乳糖的刺激，导致体内出现氧化应激反应，其血清和肝脏中SOD、CAT和T-AOC水平显著降低，而LPO和MDA水平显著升高，这与先前的研究结果一致。体外试验结果表明，黄芪多糖和黄芪锌多糖具有很好的抗氧化功能，可有效清除·OH、O2-·和DPPH自由基。体内试验结果表明，与对照组相比，黄芪多糖组和黄芪锌多糖组小鼠血清和肝脏中SOD、CAT和T-AOC水 平 显 著 升 高，而LPO和MDA水平显著降低，表明黄芪多糖和黄芪锌多糖同样具有很强的体内抗氧化能力，可缓解小鼠体内的氧化应激反应。研究也表明，锌多糖同样具有很强的体内抗氧化功能。Xie等（2021）研究表明，浒苔锌多糖可显著提高仔猪血清中GSH-Px、T-AOC和CAT水平。陈丽等（2018）研究发现，红汁乳菇锌多糖显著提高了2型糖尿病小鼠血清中SOD、CAT水平，显著降低了MDA水平。

4 结论

综上所述，本试验以黄芪多糖和硫酸锌为原料制备的黄芪锌多糖具有很好的抗氧化活性。清除·OH、O2-·和DPPH自由基的试验结果表明，黄芪多糖具有较强的抗氧化活性，而通过合成法制备的黄芪锌多糖比黄芪多糖具有更强的体外抗氧化活性；此外，体内试验结果表明，黄芪多糖和黄芪锌多糖显著提高了D-半乳糖致衰老小鼠血清和肝脏中SOD、CAT和T-ACO活性，降低了MDA和LPO水平，且黄芪锌多糖比黄芪多糖具有更强的体内抗氧化活性。