日粮添加α-酮戊二酸制剂对肉鸡肠道屏障功能的影响

袁华根，安 东，徐亚亚，高 峰*

（1.江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300；2.南京农业大学动物科技学院，江苏南京 210095）

肠道是动物体消化吸收的主要场所。肠道发育形态、消化酶活性及完整性可反映动物的生长及健康状况（Schenck等，2001）。日粮中含有的营养物质在吸收的同时也在改变肠道的生长发育，并影响其生理功能（孙德文等，2003）。谷氨酰胺能促进肉鸡肠道发育，同时也是机体免疫细胞的主要能源之一（王书平等，2009）。而α-酮戊二酸（AKG）作为谷氨酰胺的前体物质在维持肠道屏障完整和为肠道供能等方面与谷氨酰胺作用相同。目前，大多数相关研究都采用化学合成的AKG作为添加剂，而微生物发酵的AKG具有成本低、使用安全等优点，应用前景广泛。本试验以AA肉鸡为试验对象，研究日粮添加AKG制剂对肉鸡肠道形态、空肠抗氧化性能、血浆DAO含量、空肠sIgA含量及生产性能的影响，为微生物发酵法生产的AKG应用于畜禽饲料提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料1日龄AA肉鸡雏鸡，α-酮戊二酸制剂（有效含量293 g/kg）。

1.2 试验设计试验采取单因素试验设计，将192只体重无显著差异的健康1日龄AA肉仔鸡随机分为4组，其中对照组饲喂基础日粮，处理组在基础日粮的基础上分别添加0.2%、0.4%、0.8%的AKG制剂，每个处理6个重复，每重复8只鸡，试验为期42 d。肉鸡双层笼养，自由采食和饮水，自然光照加白炽灯补光，常规免疫程序免疫。

1.3 样品采集于21和42 d，在每个重复中随机挑选2只体重接近的肉鸡进行屠宰采样。用10 mL离心管采集颈动脉血液，4℃，3000 r/min离心10 min，取上清液分装于-20℃冰箱中保存。在碎冰上分离肉鸡十二指肠、空肠和回肠等组织，采集十二指肠U形弯曲上端，回肠和空肠中端肠段各1 cm，用预冷的0.75%生理盐水清洗后迅速放入4%的多聚甲醛磷酸缓冲液（pH为7.4）中固定，用石蜡切片，HE染色。除去空肠内容物，剪开肠段并用预冷的0.75%生理盐水清洗，用消毒灭菌过的载玻片分别刮取空肠黏膜于冻存管中，液氮保存待测。

1.4 指标测定

1.4.1 小肠常规HE染色和观察测定 将固定于4%多聚甲醛溶液中24 h左右的小肠各段组织制作石蜡切片，常规HE染色，镜检合格后封片。用显微镜照相系统进行观察、拍照，其中对第21和42天肉鸡肠道形态图片进行4×10倍放大，每张切片随机选取绒毛结构清晰且走向平直完整的10个不同视野；用Image-Pro Plus 6.0软件测量每个图片视野中选定的3条绒毛的绒毛高度（VH）及其相连的隐窝深度（CD），并计算绒毛高度与隐窝深度的比值（VH/CD）。最后，对每只鸡每个肠段切片样品10个视野测量值的平均值进行统计分析，每个处理为6只鸡。

1.4.2 空肠黏膜抗氧化能力指标测定 准确称取空肠黏膜样品0.3 g，将其置于10 mL离心管中，向离心管中加入2.7 mL预冷的0.75%生理盐水，边冰浴边用匀浆机2500 r/min进行匀浆。高速冷冻离心机离心10 min（3000 r/min），取上清液得到10%组织匀浆液，-20℃分装保存待测。采用试剂盒分别测定总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）及丙二醛（MDA），测定方法严格按照试剂盒使用说明书进行。样品蛋白含量使用考马斯亮蓝试剂盒进行测定。

1.4.3 血浆DAO含量测定 血浆中二胺氧化酶（DAO）含量采用酶联免疫法进行检测。

1.4.4 空肠黏膜sIgA含量测定 空肠黏膜中分泌型免疫蛋白A（sIgA）含量采用酶联免疫法进行检测。

1.4.5 生长性能测定 按重复分别在21和42 d早晨饲喂前空腹称重、结料，并计算平均日增重（ADG）。

1.5 数据统计与分析采用Microsoft Excel软件进行初步数据整理，SPASS 22.0进行单因子方差分析，采用Duncan's法进行多重比较，数据以“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 日粮添加AKG制剂对肉鸡小肠黏膜形态的影响由表1可知，21 d，0.4% AKG组十二指肠绒毛高度显著高于对照组（P＜0.05）；0.4%、0.8% AKG组十二指肠绒毛高度和隐窝深度的比值显著高于对照组（P＜0.05）；十二指肠隐窝深度随AKG制剂添加浓度的递增呈现下降趋势（P＜0.10）；0.4%、0.8% AKG组空肠绒毛高度显著高于对照组（P＜0.05）；0.4%、0.8% AKG组空肠绒毛高度和隐窝深度的比值显著高于对照组（P＜0.05）；0.2%、0.4%与0.8%AKG组回肠绒毛高度显著高于对照组（P＜0.05）；0.2%、0.4%与0.8% AKG组回肠隐窝深度显著高于对照组（P＜0.05）；42 d，0.2%、0.4% AKG组回肠绒毛高度显著高于对照组（P＜0.05）；0.2% AKG组回肠隐窝深度显著高于对照组（P＜0.05）；其他结果差异均不显著（P＞0.05）。

表1 AKG制剂对肉鸡小肠黏膜形态的影响

2.2 日粮添加AKG制剂对肉鸡空肠黏膜抗氧化能力的影响由表2可知，21 d，0.4% AKG、0.8% AKG组空肠GSH-Px活性显著高于对照组（P＜0.05）；0.4% AKG、0.8% AKG组空肠MDA含 量 显 著 低 于 对 照 组（P＜0.05）；42 d，0.2% AKG、0.8% AKG组空肠GSH-Px活性显著高于对照组（P＜0.05）；空肠MDA含量随着AKG制剂浓度的提高呈下降趋势（P＜0.10）；其他结果差异均不显著（P＞0.05）。

表2 AKG制剂对肉鸡空肠抗氧化能力的影响

2.3 日粮添加AKG制剂对肉鸡血浆DAO含量 的 影 响由 表3可 知，21 d，0.2%、0.4%与0.8% AKG组血浆DAO含量显著低于对照组（P＜0.05）；42 d，0.4%、0.8% AKG组血浆DAO含量显著低于对照组（P＜0.05）。

表3 AKG制剂对肉鸡血浆DAO含量的影响 pg/L

2.4 日粮添加AKG制剂对肉鸡空肠黏膜sIgA含量的影响由表4可知，42 d，0.4%、0.8% AKG组空肠sIgA含量显著高于对照组（P＜0.05）；其他结果差异均不显著（P＞0.05）。

表4 AKG制剂对肉鸡空肠sIgA含量的影响 pg/mg

2.5 日粮添加AKG制剂对肉鸡生长性能的影响由 表5可 知，1～21 d，0.2% AKG、0.4% AKG、0.8%AKG组平均日增重均显著高于对照组（P＜0.05）。

表5 AKG制剂对肉鸡生长性能的影响 g

3 讨论

3.1 日粮添加AKG制剂对肉鸡小肠黏膜形态的影响肠道黏膜形态结构是促进动物肠道健康及其生长性能的前提（师昆景等，2009）。小肠绒毛高度越高，隐窝深度越低，就越利于肠道对营养物质的吸收。而隐窝深度的增加则代表小肠上皮细胞的减少，因此，绒毛高度与隐窝深度的比值可在一定程度上反映小肠上皮细胞的代谢程度（Hampson，1986）。本试验在肉鸡日粮中添加AKG制剂，21 d时显著提高了小肠各肠段的绒毛高度，42 d时可显著提高空肠与回肠的绒毛高度。结果证明，AKG可改善并促进小肠早期发育和营养吸收功能。但值得注意的是，在十二指肠与空肠隐窝深度降低的同时，回肠隐窝深度显著升高，其原因有待进一步研究。

3.2 日粮添加AKG制剂对肉鸡空肠抗氧化能力的影响AKG抗氧化功能有3种：一是直接与H2O2反应分解过氧化物；二是有利于肉毒碱生成，促进脂肪正常代谢，减少自由基生成；三是参与机体GSH的合成，提高GSH的含量（Stoyanova，2011）。通常适量的自由基对机体有益，如果自由基产生过量会破坏机体正常秩序及生理代谢，严重时甚至会引发疾病。生物体细胞内存在SOD、GSH-Px等自由基清除系统，MDA是氧自由基攻击生物膜形成的脂质过氧化物之一，随着体内氧自由基活性增强，含量升高，则抗氧化作用减弱，因此，MDA高低可反映机体过氧化的程度（张克烽等，2007）。而总抗氧化能力（T-AOC）则反映非酶类和酶类抗氧化物清除自由基的总体能力。黄冠庆等（2006）报道，在黄羽肉鸡日粮中添加谷氨酰胺可显著提高血液GSHPx活性，显著降低血液MDA含量。其原因主要为谷氨酰胺是谷胱甘肽的前体物质，外源添加谷氨酰胺可提高谷胱甘肽的水平，促使GSH-Px的活性升高，从而加强了清除自由基的能力（黄冠庆和林红英，2006）。在本试验中，日粮添加AKG制剂可显著提高空肠中GSH-Px的活性，显著降低21 d肉鸡空肠MDA的含量，对42 d肉鸡空肠MDA含量也有降低趋势。

3.3 日粮添加AKG制剂对肉鸡血浆DAO含量的影响二胺氧化酶（DAO）是小肠黏膜上层绒毛中具有高度活性的细胞内酶，在组胺和多种多胺代谢中起作用，当小肠黏膜上皮细胞受损后，DAO释放入血，使血液内DAO水平升高（邓镜龙等，2017）。因此，血液中DAO含量的变化可准确反映肠道的损伤程度及完整性。在本试验中，日粮添加AKG制剂可显著降低血浆内DAO含量。说明AKG可以为肠上皮细胞补充氮源，为肠道细胞代谢提供能量，保障肠道屏障功能的完整性和正常的吸收功能。

3.4 日粮添加AKG制剂对肉鸡空肠sIgA含量的影响AKG在免疫代谢方面也具有重要作用。研究表明，外源摄入的膳食AKG能增加肠道免疫球蛋白A的分泌，增加小肠上皮淋巴结的面积，同时AKG可以提高畜禽的体液免疫、细胞免疫及非特异性免疫能力（王蕾，2010）。AKG的产物谷氨酰胺可作为淋巴细胞和巨噬细胞的主要能量来源。分泌型免疫球蛋白A（sIgA）是由消化道黏膜上的B淋巴细胞分泌出的抗体蛋白，主要存在于黏膜表面，通过免疫排斥作用阻止病原体入侵细胞，为机体提高免疫力。本试验中，日粮添加AKG制剂能显著提高42 d肉鸡空肠sIgA含量，有效提高肉鸡肠道黏膜免疫力，有利于促进肉鸡肠道健康。