长链非编码RNA LINC00342 通过靶向微RNA-384 促进肾透明细胞癌细胞增殖、迁移及侵袭

谢文杰，雷坤阳，孙 庭

南昌大学第一附属医院泌尿外科，南昌 330006

肾细胞癌是泌尿外科常见的恶性肿瘤之一，其中肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）最常见且具有发病率高、生存期短等特点。近年来，随着外科技术的进步，越来越多的早期ccRCC 患者在手术切除肿瘤后长期存活［1］。晚期ccRCC 患者往往失去了手术机会，并且对放射治疗和化学治疗不敏感，因此在晚期ccRCC 的治疗中靶向治疗十分重要［2-3］。

lncRNA 是一类不包含任何开放阅读框的长度大于200 bp 的RNA［4］。尽管lncRNA 不编码蛋白质，但它却是生物体内多种生物学过程中不可缺少的调节因子［5］。已有许多研究表明，lncRNA 与多种肿瘤的发生和发展有非常密切的联系［6-7］。多项研究表明lncRNA 在ccRCC 的发生和发展中起重要作用，它可通过多种机制促进ccRCC 细胞在体内外的增殖、迁移及侵袭［8-9］。LINC00342 是一种长链基因间非编码RNA，最早在2016 年被报道［10］。目前有关LINC00342 的研究并不少见，例如，有研究发现LINC00342 可以促进结直肠癌和非小细胞肺癌的发生和发展［11-12］。然而，LINC00342 在ccRCC 中的作用及其机制尚未见报道。本研究旨在探索LINC00342 在ccRCC 中的作用及其分子生物学机制。

1 材料和方法

1.1 基因表达谱动态分析（GeneExpression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）数据库分析 通过GEPIA 数据库分析523 例ccRCC 组织及100 例癌旁组织中LINC00342 的表达水平，并分析513 例ccRCC 样本（257 例高表达，256 例低表达）中LINC00342 的表达水平与患者生存率的关系。

1.2 临床标本的获取65 例ccRCC 组织及配对的癌旁组织来源于2020 年1 月至2021 年1 月在南昌大学第一附属医院泌尿外科接受肾癌根治术的患者，所有标本均经病理诊断为ccRCC，患者术前均未接受过放射治疗和化学治疗，组织标本采集后立即放入液氮，后转移至－80 ℃冰箱内保存供后续实验用。本研究通过南昌大学第一附属医院伦理委员会审批，所有患者均知情同意。

1.3 细胞培养及转染人正常肾小管上皮细胞系（HK-2） 及5 种 人ccRCC 细 胞 系（786-O、A498、ACHN、OS-RC-2、769-P）均购自武汉普诺赛生物科技有限公司。细胞用含有10% FBS（美国Gibco 公司）和1%青霉素-链霉素混合液的RPMI 1640 培养基于37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养，每3 d 更换1 次培养基。待细胞生长至融合度为30%～50%时，用Lipofectamine 3000（美国Invitrogen 公司）进行转染。转染分组如下：siRNA 组（转染si-LINC00342）、阴性对照（negative control，NC）组（转染LINC00342-NC）和空白对照组。转染所需的si-LINC00342、LINC00342-NC均购自汉恒生物科技（上海）有限公司。

1.4 qPCR检测LINC00342和miRNA-384表达采用TRIzol 试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司）提取组织及细胞中的RNA，用反转录试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司）合成cDNA，并进行PCR扩增。反应条件：预变性95 ℃ 30 s；变性95 ℃15 s、退火60 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 20 s，循环40次。以β-肌动蛋白及U6作为内参，采用2－ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列Tab 1 Sequence of primers

1.5 CCK-8检测细胞增殖能力 将消化、离心并重悬后的细胞按照每孔2×103个细胞的密度接种至96 孔板中，培养0、24、48、72 h 时在每孔内分别加入10 μL CCK-8 试剂（武汉赛维尔生物科技有限公司），在37 ℃条件下孵育2～4 h，用酶标仪测定450 nm 波长处的光密度（D450）值。

1.6 划痕愈合实验检测细胞迁移能力将细胞均匀地接种至6 孔板中，待细胞融合度达到80%时，用枪头在每孔中做一“十”字划痕，PBS 清洗后用无血清培养基培养，于0 h 和24 h 时在显微镜下拍照，并计算细胞迁移距离百分比。细胞迁移距离百分比=（各转染组0 h 划痕宽度－各转染组24 h 划痕宽度）/（空白对照组0 h 划痕宽度－空白对照组24 h 划痕宽度）×100%。

1.7 Transwell实验检测细胞侵袭能力 事先在Transwell 小室的上室中涂抹基质胶（美国Corning公司），待其凝固后备用。在下室中加入600 μL含20% FBS 的培养基，放入Transwell 小室。将细胞常规消化、离心后用无血清培养基重悬，在上室中加入200 μL 含2×104个细胞的细胞悬液。培养24 h 时用棉签将上室擦洗干净，用甲醇固定，0.1%结晶紫染色。风干后在显微镜下拍照、计数。

1.8 蛋白质印迹法检测上皮间质转化（epithelialmesenchymaltransition，EMT）通路相关蛋白的表达 用RIPA 裂解液（武汉赛维尔生物科技有限公司）裂解细胞后提取蛋白质，用BCA 法检测所提取蛋白质的浓度。用SDS-PAGE 分离蛋白质，并转移至PVDF 膜上。将PVDF 膜与波形蛋白（vimentin）、神经钙黏素（N-cadherin）和上皮钙黏素（E-cadherin）抗体（英国Abcam 公司）孵育过夜后，再与二抗（英国Abcam 公司）孵育1 h，最后用显影液（武汉赛维尔生物科技有限公司）对PVDF 膜进行成像，分析各条带的灰度值。

1.9 LINC00342下游靶分子的预测及验证 利用Starbase 网站和LncBook 数据库预测LINC00342 的下游靶分子，并通过qPCR 验证其表达，然后预测LINC00342 与miRNA-384 的结合位点，设计并合成LINC00342 的野生型（wild type，WT）和突变型（mutation，Mut）结合位点，构建目的质粒及阴性对照质粒。使用转染试剂［汉恒生物科技（上海）有限公司］将LINC00342-WT 和LINC00342-Mut 的目的质粒分别与miRNA-384 mimic 和NC mimic［汉恒生物科技（上海）有限公司］共转染细胞，转染48 h 后，使用双萤光素酶报告基因实验检测系统检测萤光素酶的活性。萤光素酶活性计算方法如下：萤光素酶活性＝萤火虫萤光素酶活性/海肾萤光素酶活性。

1.10 统计学处理使用GraphPad Prism 7.0 软件绘图及进行统计学分析。呈正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用独立样本t检验或单因素方差分析。呈偏态分布的计量资料以中位数表示，组间比较采用秩和检验。计数资料以例数和百分数表示，组间比较采用χ2检验。生存率的比较采用log-rank 检验。检验水准（α）为0.05。

2 结 果

2.1 LINC00342在ccRCC 组织及细胞中的表达及其临床意义 GEPIA 数据库分析结果显示，与癌旁组织相比，LINC00342 在ccRCC 组织中高表达（P＜0.05），并且LINC00342 高表达的患者总生存率低于低表达的患者（P＝0.001 8，图1）。qPCR检测结果显示，与癌旁组织和HK-2 细胞相比，LINC00342 在ccRCC 组织和5 种ccRCC 细胞系中均呈高表达，差异均有统计学意义（P均＜0.05，图2）。LINC00342 在ccRCC 细 胞 系786-O 和OS-RC-2 中表达最高，因此选择这2 种细胞系用于后续实验。根据LINC00342 表达的中位数（8.396），将65 例ccRCC 患者分为高表达组（n＝32）和低表达组（n＝33）。结果显示，LINC00342 高表达的ccRCC 患者肿瘤直径更大、临床分期更晚（P均＜0.05，表2）。

表2 ccRCC 组织中LINC00342 的表达与患者临床病理学特征之间的关系Tab 2 Relationship between LINC00342 expression in ccRCC tissues and clinicopathological features of patients n (%)

图1 LINC00342 在ccRCC 组织中的表达及其与患者总生存率的关系Fig 1 Expression of LINC00342 in ccRCC tissues and its relationship with overall survival rate

图2 LINC00342 在ccRCC 组织及细胞系中的表达水平Fig 2 Expression of LINC00342 in ccRCC tissues and cell lines

2.2 LINC00342对ccRCC 细胞增殖、迁移及侵袭的影响 CCK-8 实验结果显示，利用siRNA 沉默LINC00342 能够抑制786-O 和OS-RC-2 细胞的增殖能力（P均＜0.05，图3）。划痕愈合实验结果显示，沉默LINC00342 可使786-O 和OS-RC-2细胞的迁移能力减弱（P均＜0.05，图4）。Transwell实验结果显示，siRNA 组786-O 和OS-RC-2 细胞的侵袭能力低于NC 组及空白对照组，差异均有统计学意义（P均＜0.05，图5）。

图3 沉默LINC00342 抑制ccRCC 细胞增殖Fig 3 Silencing of LINC00342 inhibits proliferation of ccRCC cells

图4 沉默LINC00342 抑制ccRCC 细胞的迁移Fig 4 Silencing of LINC00342 inhibits migration of ccRCC cells

图5 沉默LINC00342 抑制ccRCC 细胞的侵袭Fig 5 Silencing of LINC00342 inhibits invasion of ccRCC cells

2.3 LINC00342对ccRCC 细胞EMT 的影响 蛋白质印迹法检测结果显示，沉默LINC00342 可使786-O 和OS-RC-2 细胞中波形蛋白和神经钙黏素的表达下调，上皮钙黏素的表达上调（P均＜0.05，图6）。提示LINC00342 可能通过调节EMT 进程促进ccRCC 细胞的迁移及侵袭。

图6 沉默LINC00342 抑制ccRCC 细胞中EMT 相关蛋白的表达Fig 6 Silencing of LINC00342 inhibits expression of EMT-associated proteins in ccRCC cells

2.4 LINC00342促进ccRCC 细胞恶性表型的机制 生物信息学分析结果显示，miRNA-384、miRNA-545-5p 和miRNA-19a-3p 可能是LINC00342的下游靶分子（图7A）。qPCR 结果显示，沉默LINC00342可使786-O和OS-RC-2细胞中miRNA-384的表达升高（P均＜0.05，图7B）。双萤光素酶报告基因实验显示，在786-O 和OS-RC-2 细胞中，miRNA-384 mimic 与LINC00342-WT 共 转 染 后 萤光素酶活性均下降（P均＜0.05），而miRNA-384 mimic 与LINC00342-Mut 共转染后萤光素酶活性没有出现明显下降（P均＞0.05，图7C～7E），说明miRNA-384 是LINC00342 的下游靶分子。

图7 miRNA-384 是LINC00342 的靶分子Fig 7 miRNA-384 was a target gene for LINC00342

3 讨 论

人类基因组测序结果显示，编码蛋白质的RNA只占一小部分，大部分RNA 都是非编码RNA，其中lncRNA 由于涉及多种生物学机制并且与多种肿瘤密切相关［13］，各国学者一直热衷于对其进行深入研究。随着靶向治疗的问世，针对肾癌的靶向治疗药物逐渐增多，然而其临床效果目前尚不能令人满意，探索lncRNA 在ccRCC 中的作用具有至关重要的意义［14］。本研究在初始阶段对GEPIA 数据库中的数据进行了分析，发现LINC00342 在ccRCC组织中高表达，并且其高表达与患者生存率降低有关，因此将LINC00342 作为研究对象。

本研究采用qPCR 检测了65 对ccRCC 组织及癌旁组织、5 种ccRCC 细胞系中LINC00342 的表达量，发现LINC00342 在ccRCC 组织及细胞系的表达升高，并且其高表达与肿瘤直径大、临床分期晚有关。为了验证LINC00342在ccRCC中的作用，本研究进行了一系列体外实验，CCK-8 实验、划痕愈合实验和Transwell 实验结果显示，LINC00342可以促进ccRCC 细胞的增殖、迁移及侵袭。既往研究发现LINC00342 在非小细胞肺癌中高表达，并且可以促进肺癌细胞的增殖、迁移及侵袭［11］。LINC00342 在大肠癌中不仅具有促进细胞增殖的作用，还可阻断细胞周期、抑制细胞的凋亡［12,15］。因此，LINC00342 可能与肿瘤恶性行为密切相关。

EMT 通常是指上皮细胞在经历多种变化后呈现出间质细胞表型，包括迁移能力、侵袭性和抗凋亡能力的增加，以及大量细胞外基质成分的形成［16］。EMT 的特征是上皮标志物下调、间质标志物上调、基底膜降解、细胞向间质迁移［17］。大多数肿瘤的进展往往伴随着EMT 的发生，EMT 在恶性肿瘤细胞的侵袭和迁移过程中起着至关重要的作用。多项研究表明，lncRNA 可以通过作用于EMT 对肿瘤的进展产生影响［18-19］。本研究中蛋白质印迹法检测结果显示，沉默LINC00342 可使ccRCC 细胞中波形蛋白和神经钙黏素表达下调、上皮钙黏素表达上调。由此可以推断，LINC00342 对ccRCC 进展的影响可能与EMT 有关。

miRNA-384 是一种非编码小RNA，研究表明其参与调控多种恶性肿瘤的发生与发展。miRNA-384 在胶质瘤中表达下调，上调其表达能抑制胶质瘤细胞的增殖并促进凋亡［20］。miRNA-384还可以抑制非小细胞肺癌细胞增殖［21］。在ccRCC中，miRNA-384 可靶向RAS 癌基因家族成员RAB23 来抑制细胞的增殖和迁移［22］。本研究采用双萤光素酶报告基因实验验证了miRNA-384和LINC00342 之间的靶向关系，发现miRNA-384是LINC00342 的下游靶分子之一，LINC00342 对ccRCC 细胞恶性表型的调节作用可能是通过靶向miRNA-384 而实现的。

本研究的不足之处有以下几点。首先，本研究采集的组织样本量较小，这可能使研究结论的可靠性下降；其次，由于条件有限，本研究没有进行在体实验；最后，本研究没有就miRNA-384 发挥作用的下游机制进行深入研究。

综上所述，LINC00342 在ccRCC 组织中表达上调，且与不良的临床病理学结果相关。LINC00342可以促进ccRCC 细胞的恶性表型，miRNA-384 是LINC00342 的下游靶分子之一。