人脐带间充质干细胞来源外泌体对小鼠压疮的治疗作用及机制

罗雅婷，解 婧，许 涛，谢水林，张坚松*，刘

1. 湖南师范大学医学院基础医学系，长沙410013

2. 复旦大学附属肿瘤医院中西医结合科，上海200032

3. 上海交通大学附属第六人民医院麻醉科，上海200233

4. 华南理工大学生物科学与工程学院，广州510720

5. 云南省第一人民医院转化医学中心，昆明650034

压疮又称压力性损伤，是发生于皮肤与皮下软组织的局限性损伤，损伤通常发生于活动受限患者或老年患者的骨隆突处，常与临床医疗及治疗设备的使用相关［1-2］。压疮院内患病率高，危重症患者的压疮患病率常年高于13%［3-5］。国际上将压疮分为6 期，长期卧床患者多并发3、4 期压疮［6］。3、4 期压疮治愈率低、预后差，目前尚无有效的治疗方法，长期发展可能引起脓毒血症甚至危及生命。干细胞疗法是当前皮肤损伤修复领域的研究热点。人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell，hucMSC）因增殖分化能力强、免疫原性低、获取方便、无伦理学争议等优点，是较理想的种子细胞。目前干细胞治疗仍存在体内存活时间短、过分化、致瘤性等问题，临床应用受到限制。干细胞的治疗作用依赖于旁分泌机制释放的生物活性因子［7］。干细胞来源外泌体是干细胞在静息或应激状态下分泌的参与细胞信号传递的细胞外囊泡，可通过传递特定蛋白质、RNA、转录因子等重新编程损伤细胞，促进组织再生。目前，hucMSC 来源外泌体（hucMSC-derived exosome，hucMSC-Exo）已被广泛应用于皮肤损伤修复研究［8-10］，但尚未见hucMSC-Exo 治疗压疮的报道。本研究观察了hucMSC-Exo 治疗小鼠4 期压疮的疗效，并对其治疗机制进行了初步探索，旨在为压疮治疗提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要试剂及仪器α-MEM 培养基、FBS（美国Hyclone 公司）；Ⅱ型胶原蛋白酶、透明质酸酶、TrypLETM胰蛋白酶替代物（美国Gibco 公司）；小鼠抗人CD44-FITC、CD105-藻红蛋白（phycoerythrin，PE）、CD90-PE-Cy5、CD73-PE-Cy7、人类白细胞抗原DR（human leukocyte antigen DR，HLA-DR）-FITC、CD34-PE、CD19-Texas red、CD11b-PE-Cy5、CD45-PE-Cy7 抗体（美国Beckman 公司）；间充质干细胞诱导分化试剂、去外泌体FBS（以色列Biological Industries 公司）；CD63 抗体（英国Abcam 公司）；肿瘤易感基因101（tumor suppressor gene 101，TSG101）抗体、钙联蛋白（calnexin）抗体（美国Proteintech公司）；α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗体（武汉赛维尔生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；圆形铁氧体磁铁（深圳市友达磁铁制品有限公司）；流式细胞仪（美国Beckman 公司）；CP100NX 超速冷冻离心机（日本Hitachi 公司）；NanoSight 纳米粒径分析仪（英国Malvern 仪器有限公司）；透射电子显微镜（日本JEOL 公司）。

1.2 实验动物8 周龄SPF 级雄性BALB/c 小鼠购于珠海百试通生物科技有限公司［动物生产许可证号SCXK（粤）2020-0051］，体重（26±3）g，全部单笼饲养于屏障设施环境中，构建压疮模型前适应性饲养1 周。涉及的动物实验在华腾生物医药科技有限公司［动物使用许可证号SYXK（粤）2020-0237］完成，并通过动物伦理委员会批准。

1.3 hucMSC 分离培养与鉴定实验用hucMSC采自足月妊娠剖宫产健康新生儿新鲜脐带标本，由佛山复兴禅诚医院产科提供，脐带的采集经过医院伦理委员会审批（CYIRB-LCYJ-2021066-PJ-20210629），产妇签署知情同意书。将24 h 内采集的脐带置于0.9%氯化钠溶液中，剥离脐动脉、脐静脉，分离出华通胶（Wharton’s jelly）组织，充分清洗后剪碎成约0.5～1 mm3的组织块，转入离心管中，加入0.2%Ⅱ型胶原酶与透明胶质酶于37 ℃消化1 h，以孔径为70 μm 的滤膜过滤，滤液经400×g室温离心5 min，获得细胞沉淀；加入含10% FBS 和1%青霉素-链霉素的α-MEM 培养基重悬细胞沉淀，接种于T25 培养瓶内，置于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养（标记为P0 代）；每2～3 d换液1 次，细胞生长至80%融合时进行传代，每个T75 瓶接种4×105～6×105个细胞。第1 代（P1 代）后各代细胞融合达90%以上时，按1 ∶3 比例分瓶传代，于倒置显微镜下观察细胞形态。第4 代（P4 代）细胞用于鉴定，第5 代（P5 代）细胞用于后续实验。

取P4 代对数生长期细胞，分别用成骨、成脂及成软骨分化培养基对细胞进行诱导培养，成骨分化培养10 d 后行茜素红染色，成脂分化培养至14 d 行油红O 染色，成软骨分化培养至21 d 行阿辛蓝染色，镜下观察分化效果；通过流式细胞术检测hucMSC 表面阳性标志物CD44、CD105、CD90、CD73 及阴性标志物CD34、CD19、CD11 b、CD45、HLA-DR 表达，采用CXP Cytometer 软件分析检测结果。

1.4 hucMSC-Exo 提取与鉴定取P5 代生长状态良好的hucMSC，当融合度达60%～70%时，弃去培养基，用PBS 润洗2～3 次，用含10%（体积分数）去外泌体血清的α-MEM 培养基培养48 h 后收集细胞上清。采用差速离心法提取外泌体，收集的上清以每管40 mL 分装，4 ℃条件下300×g离心10 min 去除悬浮细胞，收集上清以2 000×g离心20 min 去除细胞碎片，再收集上清以10 000×g离心30 min 去除大囊泡及凋亡小体，剩余上清经0.22 μm 针头滤器过滤后转移至超速离心管中，100 000×g离心2 h，小心去除上清，取适量无菌PBS 轻轻重悬离心管底部沉淀，获得外泌体，－80 ℃保存并用于后续实验。

对所提取的外泌体进行形态、群体特征及表面蛋白标志物鉴定。利用透射电子显微镜观察外泌体形态特征；采用纳米粒子跟踪分析技术观察外泌体布朗运动速率，计算其数目及大小分布；采用蛋白质印迹法检测外泌体表面蛋白阳性标志物CD63、TSG101 及阴性标志物calnexin 表达。

1.5 小鼠4 期压疮模型制备采用磁铁夹压法制备小鼠4 期压疮模型［11-13］。取9 只雄性BALB/c 小鼠，建模前1 d 称重，腹腔注射3%戊巴比妥钠（10 mg/kg）后褪毛，标记操作区域；建模当日小鼠制动，以背部中线为界轻拉起背部皮肤，用2 个圆形铁氧体磁铁板（直径12 mm，厚5.0 mm，平均质量2.4 g，磁力0.1 T）挤压皮肤全层，不挤压肌肉；以磁铁每挤压12 h 后放松12 h 为1 个循环，共作用3 个循环后挤压结束。常规喂养7 d 后对创面进行清创，评估建模效果。

4 期压疮建模成功标准：大体观全层皮肤及皮下组织缺失，暴露肌层；H-E 染色见大量炎症细胞浸润，皮肤、皮下脂肪及肌层变性坏死［1］。

1.6 实验分组及创面干预取27 只BALB/c 小鼠成功建立4 期压疮模型，然后按随机数字表法分为hucMSC-Exo 治疗组、PBS 对照组及模型对照组，每组9 只，清创后1 d 给药治疗。hucMSCExo 治 疗 组：将hucMSC-Exo 沉淀用 无 菌PBS 按1 μg ∶1 μL 比例充分重悬，用1 mL 胰岛素注射器抽吸后，沿创面周围0.5 cm 处4 个位点均匀皮下注射至创缘及基底，每个位点25 μL，共注射100 μL；PBS 对照组：用1 mL 胰岛素注射器沿创面周围0.5 cm 处4 个位点均匀皮下注射100 μL 无菌PBS；模型对照组：清创后未给予任何处理。

1.7 观测指标

1.7.1 创面愈合情况观察治疗后每天常规观察，直至创面愈合。于治疗后0、3、7、10、14 d 对创面进行拍照（拍摄时于创面边缘放一最小刻度为1 mm 的直尺，镜头与创面平行），用 ImageJ 图像分析软件计算创面面积（创面面积=长轴半径×短轴径×π）。创面完全被上皮组织或新生皮肤覆盖视为伤口愈合，计算创面愈合率［创面愈合率（%）＝（初始创面面积－当日测量创面面积）/初始创面面积×100%］。

1.7.2 组织学观察治疗后7、14 d 每组各取3 只小鼠，经腹腔麻醉处死后，以创面为中心取15 mm2的正方形皮肤，用4%多聚甲醛溶液室温固定48 h后脱水、石蜡包埋、切片，通过H-E 染色观察创面皮肤结构特点、肉芽组织新生及炎症细胞浸润情况，通过Masson 染色观察创面胶原纤维沉积及排列情况。

1.7.3 α-SMA蛋白表达观察 通过免疫组织化学染色观察创面α-SMA 蛋白表达。取治疗后7 d 小鼠皮肤组织石蜡包埋切片，脱蜡至水，经EDTA 修复抗原，双氧水阻断内源性过氧化物酶，血清室温封闭，加入一抗4 ℃孵育过夜，加入二抗（HRP 标记）37 ℃孵育1 h，DAB 显色，苏木精复染细胞核，脱水、透明后封片，镜下观察。

1.7.4 SOD、MDA测定 于治疗后7、14 d，每组分别取6 只小鼠腹腔麻醉后经眼静脉丛取血，室温下1 000×g离心15 min 后取血清，通过黄嘌呤氧化酶法（羟胺法）测定SOD 活力，硫代巴比妥酸比色法测定MDA 含量，参考试剂盒说明书进行操作。

1.8 统计学处理采用GraphPad Prism 7 软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著性差异法。检验水准（α）为0.05。

2 结 果

2.1 hucMSC 体外培养与鉴定结果P0 代细胞培养48 h 后可见少数贴壁，呈短棒状或多角形；72 h 后贴壁完全，细胞多呈长梭形；随后梭形贴壁细胞逐渐增多，6～7 d 形成细胞集落（图1A）；10～12 d细胞融合度可达80%以上。传代至P5 代后，细胞为大小相对均一的梭形，呈平行排列或漩涡状生长（图1B），符合间充质干细胞的形态特征。

成骨诱导培养至10 d，显微镜下可见钙结节，茜素红染色后呈深红色（图1C）；成脂诱导培养至14 d，细胞周围出现环形脂滴，油红O 染色后呈红色串珠样（图1D）；成软骨诱导培养至21 d，显微镜下可见球状细胞团，阿辛蓝染色后沉积的蛋白多糖呈蓝色（图1E）。综上观察结果提示，所培养的细胞具备多向分化潜能。流式细胞术鉴定hucMSC 表面标志物结果（图1F）显示，CD44、CD105、CD90、CD73 均为阳性表达（＞95.0%），HLA-DR、CD34、CD19、CD11b、CD45 均为阴性表达（＜2.0%），符合《临床研究用人脐带来源间充质干细胞制剂规范》［14］。

图1 hucMSC 培养及鉴定结果Fig 1 Culture and identification of hucMSCs

2.2 hucMSC-Exo 的获取和鉴定结果hucMSC 培养至P5 代，细胞数量达4×108，收集细胞上清1 200 mL，通过差速离心法提取约2 mg 外泌体。透射电镜观察所提取的外泌体直径为30～150 nm，结构完整，具有典型双层膜结构，形态呈类圆形杯盘状（图2A）；粒径分析结果显示，外泌体直径主峰为141 nm，浓度为（2.41±0.37）×108/mL（图2B）；蛋白质印迹法检测到提取的外泌体表达CD63、TSG101，不表达内质网蛋白calnexin（图2C）。综上鉴定结果显示，提取的外泌体符合标准特征。

图2 hucMSC-Exo 鉴定结果Fig 2 Identification of hucMSC-Exo

2.3 BALB/c 小鼠4期压疮模型成功制备小鼠建模后1 d，大体观背部挤压区域出现同磁铁大小一致的缺血创面，皮肤全层明显变薄；H-E 染色结果显示组织大范围损伤，皮肤及皮下组织局部坏死，伴少量炎症细胞浸润。建模后7 d，大体观清创前创面被坏死组织及焦痂覆盖，边缘内卷，肌层部分暴露；清创后创面全层皮肤及皮下组织缺失、肌层完全暴露；H-E 染色显示清创前皮肤全层坏死、部分脱落，清创后皮肤全层完全脱落，均伴肌层、肌层下结缔组织坏死及大量炎性物渗出。见图3。上述观察结果提示，建模后7 d，小鼠4 期压疮模型制备成功。

图3 BALB/c 小鼠4 期压疮模型制备Fig 3 Preparation of BALB/c mouse model with stage 4 pressure ulcers

2.4 hucMSC-Exo 促进压疮创面愈合

2.4.1 hucMSC-Exo加速压疮创面愈合 治疗后0 d，各组小鼠压疮创面无明显差异。3 d 时，hucMSC-Exo 治疗组创面覆盖薄痂，痂皮内卷，创面干燥无渗出；PBS 对照组及模型对照组小鼠创面可见少许炎性渗出，痂皮覆盖不完全。7 d 时，hucMSC-Exo 治疗组小鼠痂皮脱落，新生上皮组织形成，残余创面最小；PBS 对照组及模型对照组小鼠创面仍覆盖焦痂，炎症反应明显。10 d 时，hucMSC-Exo 治疗组小鼠创面已基本愈合，边缘毛发生长；PBS 对照组及模型对照组小鼠创面仍有少许焦痂覆盖，创面肉芽组织生长。14 d 时，hucMSC-Exo 治疗组小鼠创面愈合，皮肤颜色接近正常；PBS 对照组及模型对照组小鼠创面呈瘢痕愈合，创面发红。统计学分析结果显示，治疗后3、7、10、14 d 时，hucMSC-Exo 治疗组小鼠创面愈合率均高于PBS 对照组及模型对照组（P均＜0.05），PBS 对照组与模型对照组之间愈合率差异无统计学意义（P均＞0.05）。见图4。

图4 治疗后各组小鼠创面愈合大体观及创面愈合率分析Fig 4 Gross view of wound healing and wound healing rate of mice after treatment in each group

2.4.2 hucMSC-Exo减轻压疮创面皮肤病理损伤及炎症细胞浸润 H-E 染色结果显示，治疗后7 d，hucMSC-Exo 治疗组小鼠压疮处表皮完整，小范围轻度增厚，真皮层毛囊及皮脂腺减少，未见其他明显异常；PBS 对照组与模型对照组小鼠压疮处皮肤仍见大范围损伤，表皮增厚、断裂、局部与真皮分离，损伤处未见真皮层胶原、毛囊、皮脂腺及皮下脂肪，可见大量新生肉芽组织，伴较多炎症细胞浸润。治疗后14 d，各组小鼠表皮均完整，其中hucMSC-Exo 治疗组小鼠皮肤各层结构清晰，厚度均匀，真皮层胶原、毛囊及皮脂腺丰富，形态正常，组织未见明显异常；PBS 对照组及模型对照组小鼠局部表皮增厚，可见散在毛囊、皮脂腺结构，细胞排列紊乱，肌层肌细胞坏死，伴少量炎症细胞浸润。见图5。

图5 治疗后各组小鼠创面组织H-E 染色结果Fig 5 H-E staining of wound tissues of mice after treatment in each group

2.4.3 hucMSC-Exo促进压疮创面胶原沉积及重组 Masson 染色结果显示，治疗后7 d，hucMSC-Exo 治疗组小鼠压疮处可见真皮层大量胶原沉积，排列较疏松；PBS 对照组及模型对照组小鼠压疮处皮肤真皮层胶原较少，着色浅且分布不均。治疗后14 d，各组小鼠压疮处皮肤均可见大量胶原沉积，其中hucMSC-Exo 治疗组胶原排列规律，分布均一；PBS 对照组及模型对照组胶原排列紊乱，胶原纤维纵横交错、粗细不均。见图6。

图6 治疗后各组小鼠创面组织Masson 染色结果Fig 6 Masson staining of wound tissues of mice after treatment in each group

2.5 hucMSC-Exo治疗压疮创面愈合的机制

2.5.1 hucMSC-Exo可降低压疮创面α-SMA 蛋白表达 免疫组织化学染色结果显示，治疗后7 d，各组小鼠创面组织细胞质中均可见α-SMA 表达，呈棕黄色环状或斑点样聚合。与PBS 对照组及模型对照组比较，hucMSC-Exo 治疗组α-SMA 蛋白着色较浅，阳性表达明显减少。见图7。

图7 治疗后7 d 各组小鼠创面组织α-SMA 蛋白表达Fig 7 Expression of α-SMA protein in wound tissues of mice on day 7 after treatment in each group

2.5.2 hucMSC-Exo可改善体内氧化应激水平治疗后7 d，hucMSC-Exo 治疗组小鼠血清SOD 活力较PBS 对照组与模型对照组升高（P均＜0.05）；治疗后14 d，hucMSC-Exo 治疗组小鼠SOD 活力下降至接近正常水平，而PBS 对照组及模型对照组SOD 活力上升且高于hucMSC-Exo 治疗组（P均＜0.05）。治疗后7 d，hucMSC-Exo 治疗组MDA 含量低于PBS 对照组和模型对照组（P均＜0.05）；治疗后14 d，各组MDA 含量均下降，但PBS 对照组与模型对照组仍高于hucMSC-Exo 治疗组（P均＜0.05）。治疗后各时间点PBS 对照组与模型对照组之间SOD 活力和MDA 含量差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见图8。

图8 治疗后各组小鼠血清SOD 活力及MDA 含量变化Fig 8 Changes of serum SOD activity and MDA content of mice after treatment in each group

3 讨 论

压疮是临床常见的皮肤损伤疾病，目前常用的治疗方法有中医药疗法、湿性愈合敷料、负压封闭引流技术、皮肤再生医疗技术等，但均存在治愈率较低、易复发、治疗时间长等问题，一旦发生压疮，患者住院时间延长、生活质量下降，给家庭带来巨大经济负担的同时也大大增加了医疗资源消耗。因此，寻找新型有效的压疮治疗方法非常重要。

近年来，细胞相关疗法飞速发展，作为一种新型治疗方式，其临床转化潜力引起科学界极大关注。细胞外囊泡是细胞分泌的具有磷脂双分子层的膜结合囊泡，根据细胞起源和生物学发生可将其分为微囊泡、外泌体、凋亡小体及其他亚群［15］。其中外泌体是细胞多囊泡体与质膜融合分泌的直径为30～150 nm、大小均一的细胞外囊泡，其内含特异脂质、蛋白质、核酸等多种成分，能特异性靶向受体细胞，调节细胞间通讯及信号转导。当前应用的外泌体分离手段很难获得高纯度且单一的样品，尽管细胞外囊泡和外泌体是通过不同机制产生，但它们大小、内容物存在重叠，目前尚无可独立证明外泌体存在的方法［16］。本研究采用的hucMSC-Exo指代与外泌体生物学形态、大小相符，且鉴定结果满足2018 年国际囊泡协会颁布的最新指南要求的细胞外囊泡［17］。

伤口愈合包括凝血、炎症、增殖和重塑4 个阶段。目前已有研究证明hucMSC-Exo 可在伤口愈合各阶段发挥作用：在凝血期，hucMSC-Exo 可通过释放磷脂酰丝氨酸促进血液凝固；在炎症期，hucMSC-Exo 可分泌多种细胞因子，促进炎症细胞渗出，加快成纤维细胞及血管内皮细胞增生；在增殖期，hucMSC-Exo 可进一步促进成纤维细胞增殖、肉芽组织形成及新生血管生成；在重塑期，hucMSC-Exo 可加快再上皮化进程，促进胶原蛋白重组，进而促进伤口愈合、减少瘢痕形成［18-22］。针对多种啮齿类动物模型的安全性实验证明，hucMSC-Exo 无免疫原性、致瘤性、栓塞等风险，静脉滴注400 μg hucMSC-Exo 不会导致肝肾功能异常、肌肉和血管刺激、全身过敏反应等并发症［23］。因此，hucMSC-Exo 有望成为压疮治疗的新方法。本研究采用皮下注射100 μg hucMSC-Exo 治疗小鼠4 期压疮，与PBS 对照组及模型对照组比较，hucMSC-Exo 治疗组创面愈合速度加快，愈合质量提高，瘢痕面积较小，到治疗后14 d 时hucMSCExo 治疗组小鼠新生皮肤已同周围正常皮肤无明显差异。

伤口愈合过程中成纤维细胞增生、细胞外基质合成速率高于降解速率、创面炎症等因素共同作用会导致病理性瘢痕形成［24］。α-SMA 是肌成纤维细胞的特异性骨架蛋白，可通过调节细胞骨架构象影响肌成纤维细胞增殖，被认为是肌成纤维细胞收缩的标志，也是决定瘢痕形成的关键［25-26］。大量研究表明，伤口愈合初期α-SMA 表达增高有利于缩小细胞间距，促进伤口闭合；到后期组织中α-SMA 表达降低可减少肉芽组织血管生成，促进胶原重组，进而减少瘢痕形成［27-29］。研究人员通过高通量测序确定了一组包括miRNA-21、miRNA-23a、miRNA-125b 和miRNA-145 在 内 的hucMSC-Exo 特异性miRNA，这些miRNA 可通过介导TGF-β/Smad2 信号通路，抑制α-SMA 表达及胶原过量沉积，减少瘢痕形成［21］。同既往报道一致，本研究的免疫组织化学染色结果显示治疗后7 d hucMSC-Exo 治疗组α-SMA 蛋白表达明显低于PBS 对照组及模型对照组。结合大体观及组织学观察结果可知，hucMSC-Exo 治疗可减少压疮创面瘢痕增生、缩小瘢痕面积。

缺血再灌注损伤机制是目前公认引起压疮最重要的发病机制，氧化应激在压疮形成中起重要推动作用。间充质干细胞来源外泌体已被证明可通过多种途径改善氧化应激所致损伤［30］。在外力作用下，局部组织长期受压可导致组织灌注减少，而反复缺血-再灌注会引起微循环受损，组织抗氧化能力下降，引发过度氧化应激反应，致使大量氧自由基释放及相关代谢产物堆积，进一步加剧组织损伤［31-33］。研究表明，hucMSC-Exo 可通过释放谷胱甘肽过氧化酶 1 诱导ERK1/2 磷酸化及Bcl-2表达，进而抑制核因子κB 抑制因子（inhibitor of nuclear factor κB，IκB）/NF-κB/caspase 信 号 通 路的激活，减轻氧化应激诱导的细胞凋亡［34］。此外，hucMSC-Exo 释放的14-3-3ζ 蛋白可通过调节沉默信息调节因子1 依赖的抗氧化途径，抑制炎症反应，发挥细胞保护功能［35］。SOD 是体内重要的抗氧化酶，能及时清除氧自由基，保护细胞免受损伤，从而促进伤口愈合［36］。MDA 则是脂质过氧化反应的产物，其含量可反映组织内脂质过氧化情况及组织含氧自由基水平，与损伤程度成正比［37］。本研究中， hucMSC-Exo 治疗组小鼠血清SOD 活力在治疗后7 d 高于PBS 对照组及模型对照组并且到14 d 时接近正常水平，而MDA 含量始终低于PBS 对照组及模型对照组，表明hucMSC-Exo 可通过改善氧化应激水平促进小鼠压疮创面愈合。

综上所述，hucMSC-Exo 可促进小鼠压疮创面愈合，减少瘢痕形成，其机制可能与改善体内氧化应激水平有关。下一步我们将研究hucMSC-Exo 调控氧化应激的信号通路，从而进一步探讨hucMSCExo 治疗压疮的机制。