青贮芦苇益生菌添加剂配方的筛选

熊志达， 周鑫鑫， 杨书敏， 王金硕， 肖运才， 石德时

（华中农业大学，湖北 武汉 430070）

芦苇属多年生根茎型的高大禾本科植物，广泛分布于湿地生态系统，芦苇根茎发达，生长旺盛，再生速度快，具有极强的适应环境的能力，我国现有14个芦苇的主产区，芦苇面积可达130万公顷以上（朱作华，2017；李建国，2004）。春夏两季芦苇的营养价值丰富，具有很高的粗蛋白质含量。鲜嫩的茎叶对于反刍动物具有较好的适口性，因此春夏两季的芦苇可作为反刍动物的优质青绿饲料（项迪平，2021）。

芦苇中有较高的纤维素含量，生长期芦苇中中性洗涤纤维（NDF）含量可达到71.96%~72.81%DM，酸性洗涤纤维（ADF）含量约为37.94%~39.50% DM（康翠翠，2016），每年仅有少部分的芦苇用于反刍动物饲喂，部分芦苇用在造纸、编席和制作扫帚等经济用途中，大部分芦苇则被废弃。因此，开展对芦苇保鲜和体外降解纤维素含量的研究，对于合理开发利用芦苇资源，缓解决我国反刍动物饲料缺口问题和发展养殖业具有重要意义。

根据我国养殖业饲料缺口亟待解决的现状，以及芦苇作为青贮饲料利用的可行性，本研究利用从水牛瘤胃中筛选出来的两株产纤维素酶的益生菌：副地衣芽孢杆菌（Bacillus paralicheniformis）SN-6和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）D1，与其他适宜饲料青贮的益生菌复配，期望通过乳酸菌保存芦苇中营养物质的同时，产纤维素酶的益生菌可以有效地降低芦苇中的纤维素含量，从而达到芦苇保鲜和体外降解部分纤维素的目的，并根据青贮发酵的结果，获得最适宜芦苇青贮的益生菌添加剂配方。

1 材料与方法

1.1 试验材料 芦苇：收割处于生长前期距离根部40 cm以上的全株芦苇。菌株：副地衣芽孢杆菌（Bacillus paralicheniformis）SN-6（本研究团队从水牛瘤胃中分离得到，菌粉活菌数为1.0×1010CFU/g）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）D1（本研究团队从水牛瘤胃中分离得到，菌粉活菌数7.0×109CFU/g）、布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）LB101（购于微康益生菌苏州股份有限公司，菌粉活菌数为1×1010CFU/g）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LP194（购于微康益生菌苏州股份有限公司，菌粉活菌数为1.0×1010CFU/g）、象草发酵剂[采购于华大瑞尔科技有限公司，内含有乳酸片球菌 （Pediococcus lactis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）TL和 酵 母 菌（Yeast）等益生菌，菌粉活菌数为1.0×109CFU/g）]。

1.2 试验方法

1.2.1 不同生长阶段芦苇营养物质变化2020年6月5日~8月27日间，不定期收割处于生长期各阶段的芦苇，通过检测营养成分，确定最佳的芦苇收割时间。将样品65℃烘干后，检测生长期不同阶段芦苇营养物质的变化。

1.2.2 芦苇青贮试验 收割处于生长前期的芦苇（2021.06.04），将其粉碎至1~3 cm长。芦苇鲜样中含水量为（65±0.52）%，额外添加水（4±0.50）%，使总水量控制在70.0%左右。此外，菌添加总量设置为3×109CFU/kg，按照表1菌剂添加量，将菌剂添加入芦苇中，并根据芦苇鲜重额外添加2%糖蜜拌匀，每个密封袋中填装1 kg芦苇，用真空打包机将密封袋抽至真空形成完全封闭的空间，各组设置3个平行处理，同一菌添加剂组放入同一个带盖的密封桶中。在桶上记录日期与菌添加情况，放置阴凉处青贮20 d后，开桶检测各组青贮样品的发酵品质与营养物质。

表1 各组菌添加量

1.2.3 芦苇青贮样品品质测定 氨态氮的含量按照T/NAIA 001—2020的方法测定。乙酸、丙酸、丁酸的含量按照GB/T 22145—2008的方法测定。pH与总酸的含量按照GB/T 12456-2008（3）的方法测定。乳酸的含量按照GB/T 5009.157—2016的方法测定。粗蛋白质的含量按照GB/T 6432—2018的方法测定。干物质的含量按照GB/T 6435—2014的方法测定。粗灰分的含量按照GB/T 6438—2007的方法测定。中性及酸性洗涤纤维的含量按照GB/T 20806—2006的方法测定。毒素的含量使用黄曲霉毒素B1快速检测卡、呕吐毒素快速检测卡、玉米赤霉烯酮快速检测卡测定，检测卡均购于武汉观锐生物科技有限公司。

1.3 青贮饲料的品质评定

1.3.1 感官评定 青贮饲料的气味、色泽和结构按照德国农业协会（DLG）评分法进行评分（张养东，2016），将青贮得分分为1级优良（16~20分）、2级尚好（10~15分）、3级中等（5~9分）、4级腐败（0~4分）四个等级。

1.3.2 发酵品质评定 青贮饲料的发酵品质按照弗氏评分法（德国科学家Flieg在1938年提出的评定方法）进行评定（英华，2010）。按照得分情况将青贮芦苇分成优（81~100分）、良（61~80分）、可（41~60分）、中（21~40分）和劣（0~20分）五个等级。

2 结果与分析

2.1 处于生长期不同阶段的芦苇营养物质变化根据图1可知，在芦苇生长过程中，随着芦苇老化，水分不断降低（2020.07.17所测芦苇样本水分含量达到71.92%，可能与当时雨水较多有关）；灰分先升高后降低；粗蛋白质先升高后降低，最高可达15.68%。综合生长期芦苇水分和蛋白质含量变化，结合实地观察芦苇生长情况，得出6~7月份是收割芦苇进行青贮发酵的最佳时期。

图1 2020年6月5日-2020年8月27日芦苇营养物质变化

2.2 芦苇青贮试验结果分析

2.2.1 芦苇鲜样营养物质 表2为处于生长前期芦苇样品的营养物质含量，此时的芦苇鲜样中有较高的营养价值，粗蛋白质含量为15.38%；纤维素含量较高，NDF约为71.0%，ADF含量约为40.09%。

表2 青贮前芦苇样品营养成分

2.2.2 芦苇青贮感官评价 在为期20 d芦苇青贮试验结束后，将所有桶中的青贮袋取出并打开。发现打开的青贮袋内散发着芦苇青贮后特有的酸香味；青贮后的芦苇松散不干燥，湿润不黏手，用力挤压青贮芦苇仅有少量液体从指缝间渗出；除了Ctrl组发酵后茎叶结构保存得较差外，益生菌添加剂各组的茎叶结构保存均为良好（表3）。青贮后的芦苇饲料较新鲜芦苇略有变色，呈黄绿色，烘干后呈淡褐色。

表3 青贮芦苇的感官评价

2.2.3 芦苇青贮品质评价 由表4可知，各组的pH均属于优良发酵的水平（pH=3.8~4.2）。菌添加剂各组TA含量极显著高于Ctrl组（P<0.01），XS64组TA含量最高，达到5.84 g/kg DM，其LA含量也显著高于其他组（P<0.05），达到3.22 g/kg DM。BA含量是饲料青贮过程中是否发生腐败的重要标志之一，优质的青贮发酵饲料中，BA的含量应小于1% DM并无限接近于0，Ctrl组中BA含量为0.14% DM，复合益生菌添加剂各组BA含量均小于0.10% DM。AN的含量标志着饲料青贮过程中发生腐败的程度，青贮饲料中AN含量越低则说明饲料中蛋白质腐败程度越低。此次青贮试验中各组AN含量均小于0.1% DM。

表4 青贮芦苇的品质

2.2.4 芦苇青贮营养物质评价 由表5可知，XS64组青贮后DM含量高于其他组，可达到35.88% DM（P<0.05）。XS55的CP含 量 为12.35% DM，XS64的CP含量为12.60% DM，XSD的CP含 量 为12.67% DM，BZSD的CP含 量 为12.73% DM，Ctrl的CP含量为13.83% DM，表明通过青贮可有效地保存芦苇中的营养物质。

表5 青贮芦苇的营养物质

此外，添加降解纤维素分解菌（SN-6、D1）可以有效地降低芦苇中NDF含量。其中XS64降低NDF含量最多，较Ctrl组降低了4.74%（P<0.01）。其他添加产纤维素降解酶益生菌的各组NDF含量较Ctrl组均有下降的趋势：XS55组NDF含 量 较Ctrl组 降 低2.93%（P<0.05）；XSD组NDF含量较Ctrl组降低约为2.83%（P<0.05）；BZSD组NDF含量较Ctrl组降低约为1.79%（P<0.05）。各组均无显著降低ADF的效果。

2.2.5 青贮芦苇的发酵品质 根据表6可知，XS55组LA/TA的含量最高，为56.26%；XS65中LA/TA含量为55.22%；XSD组LA/TA为52.57%；BZSD组LA/TA为45.22%；而直接青贮Ctrl组中LA/TA含量仅为7.07%。XS55组BA/TA含量为0.04%；XS64组BA/TA含量为0.40%；XSD组BA/TA含量为0.10%；BZSD组BA/TA含量为0.11%；Ctrl组中BA/TA含量最高，为15.29%。

表6 青贮芦苇的发酵品质 %

AN/TN这一指标可评价青贮饲料的发酵品质，该值<5.0%，青贮饲料发酵品质为优，5%~10%为良好，10%~15%为中等，>15%为差，除了Ctrl组外其他各组的AN/TN含量均小于10%，结合实际观察，各组腐败程度均较低，发酵情况均属于“良好”。Ctrl组与各益生菌添加剂组之间AN/TN含量有显著差异性，为13.62%（P<0.05）。

2.2.6 芦苇青贮毒素含量 表7为芦苇青贮样品的三种饲料毒素的检测结果，由于芦苇饲料国家标准尚未制定，因此使用玉米、麸皮和豆粕的毒素检测标准（DON≤1.0 mg/kg；AFB1≤20.0 μg/kg；ZEN≤400.0 μg/kg）来评价芦苇青贮样品是否毒素含量超标。经试验检测，各组检测结果均达到常规饲料的毒素验收标准。

表7 青贮芦苇的毒素含量

2.3 芦苇发酵品质评价 根据费氏评分法对各组芦苇青贮样品发酵品质的平均值进行评分与等级划分（表8）。其中XS64组评分最高，为86分，评价为“优”。同时，XS55组也具有同样的优秀品质，评分为85，评价为“优”。此外其他两个益生菌添加组XSD组和BZSD组的评价均为“良”。Ctrl组品质差，乳酸占总酸含量极低，为7.07%，弗氏评分法的得分最低，为7分，青贮品质评价为“劣”。

表8 青贮芦苇的弗氏评价

3 讨论

3.1 乳酸菌对芦苇青贮的影响 此次芦苇青贮各处理组pH均在3.80~4.20，以pH值评分标准（中国）（刘建新等，1999）对各组进行评分，XS55组和XS64组等级为优等；Ctrl组和BZSD组青贮等级为良好。青贮中的有机酸含量及其构成，是反映青贮发酵品质最关键的指标。评价有机酸含量的重要指标为乳酸、乙酸、丙酸和丁酸（金华平，2013）。其中乳酸含量占比越高则说明青贮效果越好。各益生菌添加剂处理组中乳酸含量均极显著高于Ctrl组。丁酸由多种腐败菌分解蛋白质产生，丁酸被牛瘤胃壁吸收，转化为β-羟丁酸并导致奶牛酮病的发生。Ctrl组丁酸/总酸含量最高，为15.29%，其他复合益生菌添加剂处理组丁酸/总酸含量均小于1%。因此，添加活性乳酸菌可显著地提高芦苇青贮中乳酸的含量，并可以有效抑制腐败菌的生长从而降低丁酸的含量。氨态氮/总氮可反映青贮料中粗蛋白质与氨基酸的分解程度，益生菌添加剂各组的氨态氮/总氮的比值含量极低，均显著低于Ctrl组（P<0.05）。研究表明，在芦苇青贮过程中添加乳酸菌，可有效降低芦苇的pH，同时抑制其他腐败菌所造成的不良发酵，芦苇中的营养物质得到了较为完整的保存。

3.2 产纤维素降解酶的益生菌对芦苇青贮的影响 中性洗涤纤维（NDF）主要是细胞壁成分，NDF可作为评估青贮饲料精粗比的一个重要指标。酸性洗涤纤维（ADF）包括纤维素、木质素和硅酸盐等，当ADF含量适中时，能够有效的促进动物的消化作用；当其含量过高时，则会导致其他营养物质的消化利用率降低（晁洪雨，2012）。本研究结果表明，添加产纤维素降解酶益生菌的各组青贮饲料中的NDF含量显著降低（P<0.05），这可能与D1、SN-6所产生的纤维素酶与漆酶有关。此外，益生菌添加剂的各组中乳酸含量比Ctrl组含量更高，其原因可能是纤维素被D1和SN-6降解利用后，进一步为乳酸菌提供了青贮发酵的底物葡萄糖。

4 结论

本试验结果表明，复合益生菌添加剂具有保存芦苇中的营养物质和生理性状、提高饲料风味、降低pH、抑制腐败菌生长、降低芦苇中NDF含量等作用。