基于微卫星标记的瓯江唇鱼骨增殖放流效果评估

郭爱环 原居林 练青平 曹容玮，2 陈光美

(1 浙江省淡水水产研究所，农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室，浙江湖州 313001；2 上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306； 3 浙江丰和渔业有限责任公司，浙江丽水 323000)

唇鱼骨(Hemibarbuslabeo)隶属于鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)、鱼骨属(Hemibarbus)，广泛分布于我国闽江、钱塘江、长江、黄河、黑龙江等各大水系，是1种重要的淡水经济鱼类[1]。唇鱼骨主要以水生无脊椎动物及软体动物为食，营底栖生活，生长迅速，通常在2龄左右达性成熟，繁殖期集中在每年4—5月[2-3]。

瓯江是浙江省内的第二大河流[4]，位于浙江省东南部，属典型的山溪性河流，溪流性鱼类资源丰富[5]。近年来，由于过度捕捞、水域污染及水利工程建设等原因，瓯江鱼类野生资源日益衰退[6]，因此，开展人工增殖放流成为恢复瓯江鱼类野生资源最有效的方法之一。近年来，作为瓯江土著鱼类品种之一的唇鱼骨被大量放流，据统计，2020年浙江省唇鱼骨的增殖放流数量为9 440万尾(从全国水生生物资源养护信息采集系统统计获取)。在如此大规模增殖放流的态势下，亟须开展唇鱼骨增殖放流效果评估，为今后的增殖放流策略、实施和适应性管理提供重要参考依据。

内陆渔业增殖放流效果评估普遍采用剪鳍标记、鳞片耳石标志、体内外物理标记和化学荧光物质浸泡标记等方法[7]。与这些标记方法相比，微卫星DNA标记具有减少鱼体损伤、标记不易丢失、标记检测过程完全不受鱼类生长和活动影响等优势。此外，微卫星DNA标记具有数量大的特点，不但可以检测个体，还适合群体的大规模标记[8-9]，因此已成为准确和长期评估增殖放流效果最有效的手段[10-11]。目前已有很多基于微卫星标记进行内陆水域增殖放流效果评估的研究报道，如成为为等[12]通过微卫星标记的方法对长江上游胭脂鱼(Myxocyprinusasiaticus)增殖放流的效果进行了评估，推算出增殖放流的胭脂鱼对长江中上游野生群体的贡献率为16.92%。除此之外，通过对“四大家鱼”中的鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)和草鱼(Ctenopharyngodonidellus)开展基于微卫星和线粒体DNA分子标记的增殖放流效果评估，结果说明，连续的增殖放流活动对渔业资源量的恢复具有累加效果[13-14]。

目前，有关唇鱼骨的研究主要集中在人工繁殖[15]、养殖技术[16]、生理生化[3]、微卫星引物开发[17-19]、线粒体基因组解析[20]等方面，将唇鱼骨微卫星标记应用于其增殖放流效果评估的研究报道较少。鉴于此，本研究以瓯江唇鱼骨回捕群体和放流子代的亲本为研究对象，利用筛选出的高度多态性微卫星引物，通过亲本与回捕个体的遗传信息比对，识别回捕群体中的放流个体，对瓯江唇鱼骨增殖放流效果进行评估，以期为瓯江唇鱼骨的增殖放流提供指导和建议。

1 材料和方法

1.1 样品采集

2017年5月，在浙江省丽水市莲都区金满水产苗种场选取28尾唇鱼骨繁殖亲本，共14个分组，其中分组1由1尾雌性个体(HL-1F)和1尾雄性个体(HL-1M)配对组成。将每个分组分别放在不同孵化池中进行子代繁殖，然后将繁殖的子代转移至池塘内单独饲养。2017年12月，将繁殖的唇鱼骨子代进行放流，放流数量为5万尾，放流点为瓯江的大港头水域，具体放流点情况见表1。剪取唇鱼骨繁殖亲本的鳍条，置于4 ℃冰箱内用无水乙醇保存备用。2018年8月开始在放流区域进行放流回捕，3个采样点分别位于大港头、碧湖和南明湖(见表1)，合计回捕唇鱼骨103尾。测量回捕唇鱼骨的体长、体质量等形态学参数(见表2)，并剪取鳍条，于4 ℃冰箱中用无水乙醇保存备用。

表1 唇鱼骨放流点和采样点情况

表2 唇鱼骨子代采样信息

1.2 基因组DNA提取及PCR扩增和测序

选用10对唇鱼骨的微卫星引物[19,21](见表3)，分别在F正向引物末端标记上2种常用的荧光引物(5-HEX和5-FAM)[由生工生物工程(上海)股份有限公司合成]。PCR扩增反应体系为：25 μLTaqMasterMix(康为世纪生物科技有限公司)，2 μL上、下游引物稀释液，1 μL DNA稀释液，20 μL去离子水。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，在各自引物的退火温度下退火45 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃再延伸10 min。4 ℃保存PCR产物，然后经1%琼脂糖凝胶电泳初步检测后，用ABI 3730测序仪测取等位基因值，利用软件GeneMarker V1.5读取等位基因大小值[由生工生物工程(上海)股份有限公司测序]。

1.3 数据分析

使用Cervus 3.0[22]软件统计各微卫星位点的等位基因数(Na)、杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、多态信息含量(PIC)和非亲权排除率(NEP)。本研究用Cervus 3.0提供的最大似然法(ML)来分析亲子关系，设置95%和80%两个显著水平，设定模拟参数如下：位点应用比例为1.0；潜在基因型错误率为1%，模拟运行100 000次。利用Genepop 4.0.10软件检验微卫星位点是否符合Hardy-Weinberg平衡。

表3 10对唇鱼骨的微卫星荧光引物参数

2 结果

2.1 微卫星标记多态性

本研究使用的10个微卫星位点均能在唇鱼骨家系样本和子代中获得稳定的PCR扩增产物(见图1)。结果显示：10个位点在唇鱼骨样品中共检测出等位基因数133个，平均每个位点等位基因数为13.3个，单个位点等位基因数(Na)为7～19个；多态信息含量(PIC)为0.501～0.883，平均多态信息含量为0.703，均表现出高度多态性；期望杂合度(He)为0.523～0.897，平均期望杂合度为0.737；观测杂合度(Ho)为0.328～0.787，平均观测杂合度为0.598。另外，除了座位Hma046、HL41和HL44未偏离Hardy-Weinberg平衡，其他座位均偏离了Hardy-Weinberg平衡。唇鱼骨微卫星标记的多态性参数详见表4。

图1 唇鱼骨部分微卫星位点基因分型结果

表4 唇鱼骨微卫星标记的多态性参数

2.2 亲子关系鉴定结果分析

Cervus 3.0软件结果表明，在父母双亲未知的情况下，非亲排除率(NEP)的范围为0.043～0.400；累计非亲排除率(CEP)在第3个座位时达到0.99以上，在第10个座位时达到0.999 999 62(见表5)。

表5 唇鱼骨亲子鉴定非亲排除率和累计非亲排除率

在95%置信度和LOD值(似然率的自然对数值)大于0的条件下，在较高的座位累计非亲排除率回捕103尾样本，其中3尾回捕唇鱼骨个体经确认为本次放流的子代，因此，增殖放流对唇鱼骨自然资源的贡献率为2.91%。唇鱼骨亲子鉴定结果见表6。依据样本编号，被鉴定出来的3尾唇鱼骨中，1尾来自碧湖采样点，其余2尾来自大港头采样点。

表6 唇鱼骨亲子鉴定结果

3 讨论

3.1 微卫星座位多态性及亲子鉴定分析

亲子鉴定的准确率主要取决于微卫星位点的多态性[23]，而等位基因数(Na)、期望杂合度(He)和多态信息含量(PIC)是衡量微卫星位点多态性的重要指标。一般认为，微卫星位点的等位基因数、期望杂合度和多态信息含量越高，微卫星位点的多态性就越高。Botstein等[24]认为，微卫星标记He>0.6和PIC>0.5是最可信的辨别。本研究结果表明，10个微卫星位点的多态信息含量(PIC)为0.501～0.883，平均多态信息含量为0.703，均表现为高度多态性；期望杂合度(He)为0.523～0.897，平均期望杂合度为0.737；观测杂合度(Ho)为0.328～0.787，平均观测杂合度为0.598，因此，用于本研究的10对微卫星标记均具有较高的多态性。Hardy-Weinberg平衡是指在理想状态下，各等位基因的频率和等位基因的基因型频率在遗传中是稳定不变的，即保持着基因平衡。一般没有选择、突变、遗传漂变以及随机交配的自然种群的遗传数据都符合Hardy-Weinberg平衡。本研究10个检测位点中，只有3个座位符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，推测原因可能与样本数量有关，群体样本量较少会导致检测结果偏离Hardy-Weinberg平衡，或者SSR引物扩增可能出现无效等位基因。另外，累计排除率也是影响亲子鉴定的重要标准，如各位点排除率、位点数量和样品总数等均会影响累计排除率。研究表明，位点的等位基因越多，其排除率越高；使用的位点数越多，总排除率越高；样本数越多，总排除率越高[25]，累计排除率的最低标准一般为达到95%[26]。杨习文等[27]在对长江江苏段的鲢进行亲子鉴定时，所使用11个微卫星位点的累计排除率达99.99%以上；成为为等[12]在对长江胭脂鱼进行增殖放流评估时选用了11个微卫星位点，累计排除率为99.998 3%；李小芳[14]在对鲢进行增殖放流评估时，选用了14个微卫星位点，累计排除率为99.91%。当双亲未知，累计排除率大于99%时，亲子鉴定的结果基本可信。本研究选用了10个微卫星位点，当双亲未知时，累计排除率大于99.99%，因此，本研究选用的10个微卫星位点已含有足够的遗传信息用于亲子关系分析，由此得到的亲子鉴定结果可信度较高。

3.2 增殖放流效果评估

开展增殖放流效果评估，根据结果对其资源修复作用进行监测，可以为下一步增殖放流工作的开展提供基础数据。目前，运用分子标记技术开展增殖放流效果评估已成为准确和长期评估增殖放流效果最有效的手段之一。本研究运用此方法评估出唇鱼骨放流子代对野生群体的贡献率为2.91%，说明在瓯江的唇鱼骨群体中存在一定数量的放流个体，同时增殖放流对唇鱼骨的资源量补充起到了一定的作用。本研究增殖放流的回捕率低于已有研究中的大部分鱼类，如长江鲢的增殖放流贡献率为8.21%[27]，胭脂鱼的贡献率为16.92%[12]，而张敏莹等[28]在钱塘江开展的三角鲂增殖放流效果评估结果发现，三角鲂增殖放流的资源贡献率仅为1.08%。笔者推测，放流群体数量少是本研究回捕鱼类个体数较少的主要原因之一；另一个原因是水域面积太大，鱼类分布范围广，放流群体样本被回捕的概率较小。此外，与很多研究报道中的几百尾甚至上千尾的回捕样本数量相比，本研究回捕样本数量略显不足。但是，本研究在选取回捕采样点时，在位于两座水电站中间的水域分别选取大港头(近放流点)、碧湖(中游段)和南明湖(下游段)3个采样点，兼顾放流鱼类空间分布的同时，回收子代2年，也考虑了时间上的变化，在一定程度上弥补了回捕样品数量偏少所造成的不足，降低了回捕样品数量少对评估增殖放流贡献率的影响。

目前，增殖放流效果评估的侧重点多为对渔业资源量恢复的效果评估，而关于增殖放流人工群体对野生群体遗传多样性影响的评估有待于进一步加强。研究表明，增殖放流存在一定的遗传风险，如增加群体基因流和遗传同质性，降低有效群体大小等[29-30]。Liu等[29]对在盘锦大量增殖放流的三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)进行了遗传风险评估，结果显示，大规模的增殖放流对盘锦本地种群及辽东半岛水域种群产生了较大的遗传风险。因此，在后续的研究中，建议在充分利用微卫星基因型数据的基础上，加强对放流群体和野生群体的长期持续跟踪，为唇鱼骨增殖放流的科学评估和种质资源保护提供基础数据。

4 小结

本研究利用10对微卫星标记对唇鱼骨增殖放流效果进行评估，其累计亲权排除率为0.999 999 62，推算出增殖放流的唇鱼骨对瓯江野生群体的贡献率为2.91%。研究结果表明，瓯江增殖放流的唇鱼骨具有一定的资源恢复效果。此结果对其资源保护和后续开展科学增殖放流具有重要指导意义。