eRNA在泌尿系肿瘤发生、发展中的研究进展

熊泽众 葛越 王志华

【摘要】非编码RNA是近年来肿瘤研究的热点，其在多种不同疾病的发生和进展中发挥着不同的作用。增强子RNA(eRNA)是从增强子转录过来的非编码RNA，近年来随着高通量测序技术(RNA-seq、ChIP-seq、ATAC-seq、RIP-seq、Hi-C等)的迅速发展，对于eRNA的研究也逐渐成为基础和临床研究的热点。eRNA在多种泌尿系肿瘤的发生、发展中均有着重要的作用，并且其表达具有组织特异性，有望成为指导临床诊断、治疗、预后预测的分子指标。本文简短地总结了eRNA的产生、分类、分子特征、作用机制，以及其在泌尿系肿瘤中的研究进展。

【关键词】eRNA； 泌尿系肿瘤； 基因转录

增强子RNA(enhancer RNA, eRNA)是长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)的一个子类，它是从增强子区域转录而来的，其在基因转录调控中发挥着重要作用[1-5]。增强子可以控制多种细胞类型的选择和维持，增强子失调也是多种癌症背后的驱动因素。然而，对于eRNA与泌尿生殖系肿瘤发生、发展相关性的研究仍然较少。本文将从eRNA的产生、分子特征、分类、作用机制，以及其在泌尿系肿瘤中的研究进展等方面来进行阐述，以期为eRNA在泌尿生殖系肿瘤的诊断、治疗方面提供一定的理论依据。

一、eRNA的产生

eRNA是lncRNA的一个子类，它是从增强子区域转录而来，其在基因转录调控中发挥着重要作用[1-5]。eRNA产生于活性增强子，能够产生eRNA的活性增强子具有以下分子特征[2,4]：①具有一个开放的染色质状态，表现在存在DNA酶高度敏感的位点；②与转录因子、转录辅助因子的结合，包括组蛋白乙酰化酶p300和cAMP反应元件结合蛋白(CREB binding protein, CBP)等；③活性增强子区域以H3K4me1与H3K27ac的共同存在为标志。

二、eRNA的分类

活性增强子可以单向或者双向转录生成eRNA，这种方向性转录产生了不同类型的eRNA。但是，由于目前的技术手段存在一定局限性，可能还存在一些未知的eRNA类型没有被鉴定出来，使得eRNA在现有研究中的分类还不完全。目前发现的eRNA类型主要是非多聚腺苷酸化(polyA-)和多聚腺苷酸化(polyA+)的eRNA。两者的主要区别[6-7]：①长度：polyA+ eRNA比polyA- eRNA更长；②染色质特征：polyA+ eRNA相对于polyA- eRNA拥有较低的H3K4me1/me3组蛋白修饰比例；③方向性：polyA+ eRNA一般是从增强子区域单向转录而来，也称1d-eRNA，而从增强子区域双向转录的通常是polyA- eRNA，也称2d-eRNA，后一种转录现象比较常见。

三、eRNA的分子特征

由于增强子转录产物多种多样，使得eRNA的长度不确定，但eRNA的长度一般不超过几百个核苷酸[8]。在转录起始位点(transcriptional start site, TSS)运用全基因组测序的方法可以区别eRNA与lncRNA、mRNA的分子特征，eRNA与其他转录本的组蛋白修饰有如下差异：eRNA在TSS处拥有高水平的H3K4me1、低水平的H3K4me3、低密度的CpG，而mRNA和lncRNA在这些方面的水平则刚好相反。此外，Lam等[9]的研究表明eRNA的半衰期比mRNA和非编码RNA短。但是通过对总的RNA聚合酶Ⅱ富集以及新生RNA转录本分析，发现eRNA与mRNA和lncRNA在TSS上有相似的转录起始率。相比mRNA和lncRNA而言，eRNA的表达具有极强的组织和细胞特异性[8]。

四、eRNA的作用模式与机制

有研究报道eRNA会影响基因表达[10-11]，eRNA影响基因表达一般存在两种不同的模式：一种是初期形成的eRNA能够募集其合成部位的蛋白复合物使局部活化(顺式作用)；特定的eRNA已经被证明可以通过与组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase, HAT)CBP和BRD4的相互作用来发挥调控作用[12-13]，CBP是一种转录共刺激因子，由增强子活性区域转录而来的eRNA可以通过结合CBP以一种活性依赖的方式来刺激组蛋白的乙酰化进而激活转录，CBP可以募集RNA聚合酶Ⅱ与增强子结合来促进转录的激活[12]。BRD4是通过与增强子和启动子上乙酰化组蛋白和非组蛋白相互结合来调控基因表达，其在炎症和癌症的发生、发展中起到了至关重要的作用，BRD4还能够与多种转录因子相互作用，进而在基因调控中发挥作用。此外，BRD4还可以在启动子和蛋白编码基因内，通过招募活性形式的正相转录延伸因子b(positive transcription elongation factor b, P-TEFb)以及组蛋白分子伴侣来使RNA聚合酶Ⅱ延长，进而起到促进转录的作用。然而，其机制尚未完全清楚，仍有待进一步探究[13]。另一种是eRNA可以募集远距离甚至是其他染色体上相关的蛋白复合物发挥远端调控作用(反式作用)。如：在人类前列腺癌中，一个与激肽释放酶3(KLK3)基因相邻的eRNA可以通过反式作用增强雄激素受体(androgen receptor, AR)依赖的基因表达[14-16]。eRNA调控基因转录的作用机制主要有以下几个方面。

1.eRNA与蛋白质相互作用调控染色质成环：第一个机制是eRNA通过促进染色质成环来促进基因的转录。eRNA通过与黏连蛋白和中介体复合物的相互作用增加DNA成环，从而稳定增强子-启动子(E-P)循环[4]。多项研究中对eRNA的敲除表明，eRNA对于增强子和启动子相互作用的形成和稳定至关重要。如：在前列腺癌中，eRNA通过与蛋白因子(例如：MED1)结合来调控染色质成环[15]。在乳腺癌中，雌激素调控的eRNA可以和RAD21和SMC3结合来稳定染色质成环[8]。同样，胃癌细胞中的异质核核糖核蛋白U(hnRNPU)、结肠癌细胞中的CCCTC-结合因子(CTCF)均通过染色质成环来调节基因转录[2,15]。

2.eRNA可以直接与转录辅助因子相互作用以调节组蛋白乙酰化和基因激活：大多数增强子含有富含H3K27ac的核小体，它是被HAT CBP和p300所催化形成的。eRNA可以直接与转录辅助因子相互作用以调节组蛋白乙酰化和基因激活，例如：eRNA与转录共激活因子相互作用，与CBP/p300、BRD4结合来调控基因转录[12]。Bose等[12]发现，小鼠胚胎成纤维细胞中的多个eRNA与CBP的催化HAT结构域内的RNA结合区结合，这有助于CBP与其底物组蛋白结合并刺激HAT活性。Rahnamoun等[13]的研究表明BRD4是一种关键的转录共激活因子和致癌基因，直接与人结肠癌细胞系中的eRNA相互作用。eRNA-BRD4相互作用进而促进BRD4与乙酰化染色质区域结合以诱导炎症基因的转录激活。这些研究表明，eRNA可以直接与转录辅助因子相互作用以调节组蛋白乙酰化和基因激活[2,12-13]。

3.eRNA通过“转录因子陷阱”的过程来调控基因转录：eRNA与转录因子相互作用使其与增强子区域结合增加从而促进基因的转录。例如：Sigova等[14]发现在小鼠胚胎干细胞中，eRNA对于将转录因子YY1结合在增强子区域起到了重要的作用。eRNA的转录减少阻止了YY1在增强子区域的结合。相反，运用CRISPR-Cas9技术人工将特定的eRNA结合到增强子区域促进了YY1与增强子的结合。这就表明eRNA可能直接调控转录因子与DNA元件结合来调控基因转录，而且这种调控方式对于基因的转录循环起到正反馈调节的作用。

4.eRNA促进RNA聚合酶Ⅱ由暂停到释放以促进转录延伸：RNA聚合酶Ⅱ暂停由负延伸因子(negative elongation factor, NELF)和DRB敏感性诱导因子(DRB sensitivity-inducing factor, DSIF)诱导，它们直接与RNA聚合酶Ⅱ和新生的mRNA转录本结合。eRNA可以通过结合延伸因子来调节靶基因启动子处的RNA聚合酶Ⅱ暂停与释放，使它们远离启动子。Schaukowitch等[15]在小鼠的神经元中发现，eRNA促进RNA聚合酶Ⅱ由暂停的状态释放，eRNA通过RNA识别基序结合NELF复合物的NELF-E亚基，从而与NELF复合物结合，使其远离先前基因。在另一项研究中，Zhao等[16]发现，PSA eRNA，也称为KLK3e，通过与P-TEFb形成复合物来促进顺式和反式基因转录。其他研究也已经证明了单核细胞中eRNA(SERPINB2e和ADAMEC1e)和NELF或P-TEFb之间的相互作用[8]。这些研究共同表明，特定的eRNA通过在RNA聚合酶Ⅱ暂停与释放过程中与延伸因子相互作用来促进转录延伸[2,17-21]。

五、eRNA在泌尿系肿瘤中的研究进展

1.eRNA与前列腺癌：在世界范围内，前列腺癌发病率位于男性恶性生殖肿瘤的第二位；随着我国老龄化社会进程加剧和人们生活方式的改变，前列腺癌已位居我国男性泌尿生殖系肿瘤发病率第一位[21-22]。国内前列腺癌患者进入临床干预时多数已处于进展期或转移性前列腺癌，对于此类患者，雄激素剥夺治疗(androgen deprivation therapy, ADT)是目前最为广泛使用的基础治疗方法。然而，几乎所有的前列腺癌患者在接受一段时间ADT治疗后，常常由最初的激素敏感性前列腺癌逐渐转变为去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer, CRPC)[23]。一旦进展至CRPC阶段，即使在去势治疗的条件下肿瘤细胞仍然会快速增殖并发生转移，最终导致患者死亡。有研究表明，CRPC患者中位生存时间仅为14个月[24]，因此寻找治疗CRPC的新手段是很有意义的。

PSA代表了一类非传统的基因，其肿瘤生物学意义不仅体现在其蛋白功能上，还体现在其他功能方面，如eRNA。在CRPC中，Zhao等[16]的研究表明，PSA基因除了作为一个生物标志，从其增强子还可产生具有重要功能的eRNA——PSA eRNA。PSA eRNA通过顺式和反式两种作用机制，在增强异常AR活性和CRPC细胞活力方面发挥了关键作用。这些结果表明了有效靶向PSA eRNA用于CRPC患者治疗的可能性，单独或联合其他抗癌药物，如：抗雄激素药物(比卡鲁胺或恩扎卢胺)，可作为临床CRPC治疗的一种选择。随着其他AR-eRNA功能的揭示，可以设想联合敲除一系列AR-eRNA可能会在更大程度上抑制前列腺癌的发展。除了顺式调节PSA mRNA表达外，PSA eRNA可以反式调节参与雄激素作用的基因亚群的表达、细胞增殖、存活、生长以及迁移和侵犯。这些结果表明，通过靶向功能性AR-eRNA阻断关键增强子的活性可能为CRPC治疗开辟新的途径[14-15]。

2.eRNA与膀胱癌：膀胱癌是常见的泌尿系肿瘤，虽然随着医疗水平的提高，对膀胱癌的诊断、治疗均取得了较大进展。但仍有部分患者发现较晚，预后较差，因此迫切需要更敏感的预测预后的生物标志物及更有效的治疗方法。

雌激素在膀胱癌的发生、发展中发挥着重要的作用，尽管膀胱癌大多发生在男性，但是女性患者有更加侵袭性的表型以及更低的生存率。Ding等[25]的研究表明，P2RY2是一种G蛋白偶联嘌呤受体，并且在正常组织中广泛存在。在膀胱癌组织中，雌激素可以诱导P2RY2增强子转录生成eRNA(P2RY2e)，参与多种生物过程的调节。研究者对38对膀胱癌和对应的癌旁组织提取样本RNA后，运用逆转录PCR方法检测P2RY2e的相对表达水平，结果表明其P2RY2e表达水平增加，P2RY2e在膀胱癌5637细胞系中上升3.95倍，在T24细胞系中上升3.54倍；随后通过CCK-8、Edu实验检测细胞增殖，Transwell实验检测细胞迁移活性，caspase-3 ELISA实验检测细胞凋亡，发现P2RY2e可以促进膀胱癌细胞的增殖、迁移和抑制癌细胞凋亡，P2RY2e与膀胱癌高组织学分级、肿瘤侵袭性和高TNM分期呈正相关。以上结果表明P2RY2e可以作为膀胱癌发生和进展的驱动因素。同样，在Che等[26]的研究中发现了一种名为SMAD7的蛋白，它是可以通过多种机制来拮抗TGF-β1信号通路的一种细胞内蛋白。其对应的增强子在雌激素的刺激下可以转录成为功能的转录本——SMAD7 eRNA(SMAD7e)。SMAD7e也被证明和P2RY2e起到了相似的作用[25]。以上结果表明，P2RY2e和SMAD7e与膀胱癌的诊断、分期、分级，特别是预后密切相关，并且Cas13a-P2RY2e(SMAD7e)可能是抑制膀胱癌发展的一种有效的方法[25-26]。

3.eRNA与肾癌：肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)是最常见的肾细胞癌组织学类型，其具有很高的转移率和死亡率。尽管ccRCC的治疗方式在近年来得到了不断的改进，但其死亡率仍在增加。因此，必须确定有效的预后生物标志物，以识别生存率低的高危患者。

Jiang等[27]运用生物信息学方法确定了2 695种eRNA及其预测靶点，确定了EMX2OS是ccRCC中关键的代谢相关eRNA。使用Kaplan-Meier生存分析和相关性分析显示，EMX2OS是与生存率显著相关的eRNA，它与预测的靶标EMX2具有高度的相关性；在根据年龄、性别、AJCC分期的方差分析中，年龄>60岁和≤60岁组、男性和女性组、不同AJCC分期组的方差分析结果表明，EMX2OS表达的下调与年龄(P<0.001)、性别(P<0.001)、AJCC分期(P<0.001)显著相关。同时，与正常肾组织相比，ccRCC组织中的EMX2OS表达显著下降，EMX2OS表达下降与临床病理特征(较高的组织学分级、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移和晚期AJCC分期)显著相关。多变量Cox回归分析证实EMX2OS在ccRCC中发挥独立的预后作用。为了验证上述结果，研究者使用来自癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)的32种其他类型癌症的数据作为内部验证数据集，并使用12对ccRCC和正常组织样本的RT-qPCR分析作为外部实验验证。RT-qPCR结果进一步证实了ccRCC中EMX2OS的下调，所有结果一致表明EMX2OS起到了抑制ccRCC发生、发展的作用。此外，研究者还进行了功能富集分析，GO结果表明EMX2OS可能影响肿瘤脂肪酸和丙酮酸的代谢，KEGG结果表明其可能通过FOXO和PPAR信号通路来影响肿瘤的能量代谢和生长。因此，推测EMX2OS可能通过增加FOXO和PPAR信号通路影响能量代谢进而影响ccRCC预后。

这项研究表明EMX2OS这种eRNA可能具有预测肾癌预后的作用。由于EMX2OS在能量代谢方面具有潜在的作用，也可能成为ccRCC患者新的治疗靶点。

六、问题与展望

eRNA与泌尿系恶性肿瘤的研究仍处于初步探索阶段，不同研究机构的工作集中在一种或几种eRNA的表达调控作用上，eRNA的调控机制尚未研究透彻。泌尿生殖系肿瘤发病受多因素影响，一种肿瘤可能与多种eRNA相关。如何快速准确发现与肿瘤相关的eRNA，是首先要解决的问题。eRNA调控过程中参与的基因、蛋白，调控涉及的信号通路有待进一步研究；eRNA在不同肿瘤中发挥着不同作用，如PSA eRNA在前列腺癌细胞中促进肿瘤增殖、侵袭[21]，在肾癌中EMX2OS则抑制肿瘤发生、发展[27]，其作用机制也有待研究解答。

随着时代的发展，新的测序技术的不断产生，如全基因组新生转录本测序(GRO-seq)、RNA纯化染色质分离结合测序(CHIRP-seq)、染色质免疫共沉淀结合测序(ChIP-seq)[28]、RNA免疫沉淀结合测序(RIP-seq)等，合理地运用这些方法，也将有利于研究eRNA在泌尿系肿瘤发生、发展中的作用机制，有利于早日将其应用于泌尿系肿瘤的早期筛查、诊断、分期、预后预测乃至治疗。