基因编码技术应用研究进展

韩 雪，司迎，邢登祥，付笛语

1.北部战区总医院 医学信息数据室，辽宁 沈阳 110003 ；2.武警辽宁省总队医院 医学影像科，辽宁 沈阳110000 ；3.大连医科大学，辽宁 大连 116044

基因编码是将基因插入、删除和替换基因序列的基因工程技术，是研究基因功能、了解疾病遗传机理、探索疾病基因治疗的新技术革命，该项技术于2020 年获得诺贝尔奖。基因编码技术包括四种不同类型，分别是巨型核酸酶、锌指核酸酶、转录激活样效应因子核酸酶和成簇规律间隔短回文重复（clustered regularly interspaced short palinmic repeats，CRISPR）系统。由于CRISPR 技术操作简单，便于开发利用，本文着重对该项技术在医疗领域的应用进展作一综述。

1 CRISPR 简介

1987 年，日本科学家Ishino 发现了一段聚集规律性间隔短回文结构，此后又发现除CRISPR 回文结构外的其他结构［1-2］。CRISPR 是一种古细菌获得性的免疫系统，作为细菌防御机制，防护噬菌体或质粒对细菌的入侵，防止外来基因插入宿主基因［3］。其基本原理是当细菌首次遭到入侵时，细菌将入侵生物的遗传物质标记，形成规律性间隔序列的识别区；再次遭到入侵时，入侵微生物的遗传物质能够被识别，并被降解［4］。即通过CRISPR 相关RNA 识别微生物的基因片段，并引导Cas 蛋白酶切割、水解入侵微生物的外源基因［5］。根据两侧的Case 基因和外源DNA 的位置，CRISPR 分为两类。根据CAS 蛋白不同分为Cas3（I 型）、Cas9（Ⅱ型）和Csm/Cmr（Ⅲ型）。近几年，利用这一重大发现开发了多种基于基因编码技术的新的临床治疗手段和治疗方法，开辟临床疾病治疗新途径。

2 CRISPR 应用原理

CRISPR 通过非同源端联接（non-homologous end joining，NHEJ）和同源性定向修复（homology-directed repair，HDR）两种方式进行基因敲除和基因敲入，以纠正特定基因的错误编码。NHEJ 是在不使用同源DNA 的情况下形成双链DNA 的切口，在没有内源DNA 模板时启动DNA 删除、插入和修复［6］。由于NHEJ 的修复特征，其被认为是一个容易出错的修复方式，可能导致在序列中引入随机插入和移位，导致基因敲除、插入或缺失的基因不完全截断，并最终编码蛋白错误，NHEJ 的基因编码技术不限于特定的细胞周期相位。另一种基因编码技术HDR 基因修复发生在S 或G 相位，且使用姊妹染色单体作为同源修复的模板［7］。HDR 是一种更精确的DNA 修复机制，其实际应用成为研究的焦点［8］。目前，基于上述两项原理，已经开发出多种基因编码技术，用以研究靶向基因的敲入和敲除，进而研究基因功能，并利用这些技术治疗多种疾病。

3 基因编码技术的实际应用

随着CRISPR 技术的日益完善及对疾病遗传学认识的不断深入，在利用基因编码技术改正错误基因、治愈疾病方面取得了很大进展。

3.1 血友病 血友病是X 染色体相关遗传学疾病。利用腺病毒载体和CRISPR/Cas9 开发新的治疗方法，恢复第九因子功能取得一定效果［9］。为恢复血友病患者第九因子基因的功能，腺病毒AAV8 载体系统携带Cas9 cDNA 和引导sgRNA 转染血友病肝细胞，并移植到免疫缺陷小鼠体内建立动物模型，转染的载体在第九因子基因附近的外显子中创建双链切口，并将cDNA 插入基因的内含子，通过基因编码修正血友病细胞基因，恢复第九因子凝血功能［10］。由于腺病毒载体基因组免疫源行性，腺病毒载体导致不良免疫反应是该试验的主要问题。因此，使用干细胞载体可能更适合血友病治疗。有研究报道，将来自血友病患者外周血单核细胞的干细胞系通过CRISPR/Cas9 插入完整的第九因子基因，随后将这些细胞注射到免疫缺陷小鼠体内，移植小鼠的干细胞可产生人类九因子分泌［11］。该结果意义重大，可作为未来临床治疗的基础，基因编码技术的研究为血友病治疗带来新希望。

3.2 杜氏肌营养不良症 杜氏肌营养不良症是X 染色体相关基因突变引起的隐性肌肉萎缩疾病，基因突变导致抗肌萎缩蛋白水平降低［12］。男性携带一条X 染色体，患病率较高［13］。在杜氏肌营养不良症基因突变中，大部分是外显子中基因缺失［14］。使用造血干细胞或成肌细胞的离体扩增，尝试修补或替代受损组织，未能取得有效的治疗效果，是因这些细胞不能在肌肉组织内移植［15-16］。而如果利用CRISPR 将多能干细胞进行基因敲入后，则能生成具生抗肌萎缩蛋白的祖细胞，并在肌肉组织中大量再生。因此，基因敲入干细胞是治疗杜氏肌营养不良症的最佳治疗方案之一［17］。近几年，全球医学领域开展了多种针对肌萎缩疾病的治疗研究，包括寻找抗肌萎缩蛋白的替代蛋白以维持肌肉功能、尝试恢复杜氏肌营养不良基因表达、干细胞疗法［18］，以及基因编码治疗等。这些治疗手段中，基因编辑技术是较有效的治疗技术。即从杜氏肌营养不良症患者成纤维细胞中收集可诱导干细胞，经CRISPR 转染44 外显子基因插入，恢复抗肌萎缩蛋白合成。使用CRISPR/Cas9技术敲除杜氏肌营养不良症患者心肌和横纹肌来源的多能干细胞45～55 外显子后发现，抗营养不良蛋白合成恢复，进而肌酸激酶活性恢复，这两个基因的联合敲除也可导致肌纤维不稳定和降解［19］。在杜氏肌营养不良症基因缺失的小鼠体内，利用CRISPR 技术比较NHEJ 和HDR 对杜氏肌营养不良症基因的突变修复效果，基于NHEJ 修复的小鼠抗肌萎缩蛋白表达恢复更好，但易导致基因诱变形成［20］。

3.3 神经退行性疾病 阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病是由于基因突变导致中枢神经系统功能障碍引起，临床难以治愈［21］。研究表明，家族性阿尔茨海默病是由于编码淀粉样蛋白的前体蛋白基因点突变或缺失前体蛋白所致，为CRISPR/Cas9治疗神经退行性疾病提供广阔的前景［22-23］。对家族性阿尔茨海默病中染色体1q31-42 进行分析，发现早衰蛋白2 中有一个点突变，与β 淀粉样肽的比值显著增加相关联，该突变导致阿尔海默氏患者认知能力下降、短期记忆丧失，主要是由于基底前脑胆碱能神经元损伤导致神经元细胞内质网的电压门控钾的变化通道表达改变，神经元内质网中钙浓度增加［24-25］。将健康的基底前脑胆碱能神经元（basal forebrain cholinergic neurons，BFCN）移植到阿尔茨海默病小鼠模型中，学习能力显著提高［26］。

3.4 癌症 ID8 是可种植转移的鼠卵巢高恶行浆细胞癌，利用CRISPR/Cas9 敲除TP53 和BRCA2 基因，TP53 和BRCA 基因表达降低，但癌细胞ID8 依然具有恶行浆液性癌的特征［27-28］。将基因敲除的癌细胞种植小鼠腹腔后其肿瘤微环境免疫抑制细胞明显增加，内皮淋巴细胞聚集，癌细胞丧失形成与双链切口修复相关病灶的能力，对二磷酸腺苷-核糖聚合酶抑制敏感［29］。表观基因组编辑是治疗癌症的另一种治疗方法，其中，dCas9 与组蛋白修饰剂相连参与DNA 甲基化，干扰相关癌症进展，如大多数癌症存在DNA 过度甲基化［30］。为确定CRISPR/Cas9 系统对恶性肿瘤甲基化的作用，利用人髓性白血病K562 细胞，在异柠檬酸脱氢酶双链切口点突变，结果表明突变后K562 细胞体外形成克隆能力提高，这是由于组氨酸在突变细胞中的高度甲基化［31］。CRISPR 技术可用于肿瘤细胞的生长特性、抗药性和瘤体转移等研究，并开发双细胞CRISPR（2CT-CRISPR）测试技术［32］。该测试由两种类型组成，其中，免疫T 细胞为效应细胞、肿瘤细胞为靶细胞，该测定目的是识别因子介导免疫后瘤细胞的生长特点，并制定有效的治疗方法、提高癌细胞的特异性免疫疗法。

3.5 艾滋病 人类免疫缺陷病毒-1 通过CD4 受体与CC趋化因子受体5（anti-CCR5/RANTES，CCR5）和CXC 趋化因子受体4 相互作用入侵宿主免疫细胞。虽然人类免疫缺陷病毒-1 联合逆转录病毒的治疗改善了患者生活质量，但未能从体内根除人类免疫缺陷病毒-1［33］。研究发现，CCR5 中32 个bp的等位基因缺失导致CCR5 基因失活，从而抵抗人类免疫缺陷病毒-1 感染［34］。2000 年，1 例人类免疫缺陷病毒-1 阳性的急性髓系白血病患者接受携带CCR5 △32/△32 细胞的供体骨髓移植，结果人类免疫缺陷病毒体内复制终结，体内未检测到人类免疫缺陷病毒-1［35］。用基因编码技术将人CD34+造血干细胞/祖细胞敲出3 号染色体上的CCR5 位点，建立CCR5-/-克隆细胞株［36］。将这些细胞克隆移植免疫缺陷小鼠体内，观察小鼠人类免疫缺陷病毒-1 感染情况发现，其在免疫缺陷小鼠体内的复制被控制［37］。另一研究报道，具有未突变CCR5 等位基因（纯合子）细胞中的病毒复制速率较具有突变的CCR5 等位基因（杂合子）的细胞更快，这表明具有同质性的细胞需要敲除两个等位基因才能参与人类免疫缺陷病毒的感染抵抗［38］。

3.6 镰状细胞贫血病 镰状细胞贫血病是一种隐性遗传性疾病，带有引导RNA 序列的CRISPR/Cas9，其会特异性作用于人肾细胞中的镰刀形贫血病的血红蛋白基因和CCR5 基因；且被发现其脱靶效应与前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）相关联，即会进而减少或消除CRISPR/Cas9（120.40）靶基因的切割［39-40］。CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性与sgRNA 和前间区序列邻近基序PAM 之间距离直接相关［41］。此外，为了纠正镰状细胞贫血病的突变，含有Cas9 蛋白的核糖核蛋白和sgRNA 组成sgRNA G10，靶向HBB 基因的第一个外显子，用ssODN 被引入人类镰状细胞贫血病患者的血液样本造血干/祖细胞，结果证明使用CRISP/CAS9 可有效进行基因校正，减少脱靶效应，且与以往研究相比，HDR 能够最佳激活［41］。

4 结语

近年来，CRISPR 技术在研究基因功能、揭示遗传疾病病因、开发新的治疗手段方面取得可喜成绩，其转染效率高、脱靶效应少、易于操作等特点，日益得到广泛应用。2020 年，利用CRISPR 技术进行心脏处理，改变移植心脏的免疫源性，心脏移植取得了巨大成功，为基因编码技术的临床应用开辟广阔前景［42］。