基于气质联用技术的乳香醋炙前后挥发油成分变化分析❋

郑立红，刘振丽，宋志前，王 淳，彭诗涛，李林福，宁张弛△

(1.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010；2.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700；3.赣南医学院药学院，江西 赣州 341000)

乳香为橄榄科植物乳香树BoswelliacarteriiBirdw.及同属植物Boswelliabhaw-dajianaBirdw.树皮渗出的树脂，具有活血定痛、消肿生肌的功效[1]。历代医家认为乳香气味辛烈，具有强刺激性，虽活血消肿止痛能力较强，但多以外用为主，口服易引起呕吐，因此乳香的炮制受到了极大重视。据文献记载，乳香的炮制始于唐代，有水飞、风干、醋炙等方法，现代临床治疗多以醋乳香入药。

挥发油类成分是乳香的主要成分之一[2]。传统中药炮制理论认为，醋炙可除去部分挥发油成分，消除其对胃黏膜的刺激性。目前针对乳香挥发油类成分的研究已有报道，其化学成分主要为单萜、二萜类、烯类和酯类成分，具有镇痛、抗菌及抗氧化的活性[2-6]。但是，醋乳香为临床治疗应用的主要规格，关于醋乳香挥发油成分的研究还较少，乳香醋炙后挥发油成分的变化尚未阐明。现行的醋乳香炮制国家标准仅以“炒至表面光亮”为准，由于缺乏规范的工艺，使醋乳香的质量水平参差不齐，难以保证临床治疗效果发挥的稳定性。挥发油成分作为醋乳香中的一类重要组成成分，阐明醋炙过程对其的作用是亟待解决的问题之一，同时醋炙过程中的温度和时间条件对乳香挥发油成分的作用也需进一步探索。

本研究拟采用气相色谱质谱联用技术(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)检测乳香和醋乳香的挥发油成分变化差异，同时考察了醋乳香炮制过程中炮制温度和炮制时间对挥发油成分及其相对含量的影响，为醋乳香的药效物质发现奠定基础，同时也为制订合理的乳香醋炙工艺提供科学依据。

1 材料

1.1 主要药物、试剂及仪器

表1示，所收集到的市售乳香及醋乳香，经北京中医药大学刘春生教授鉴定均为橄榄科植物乳香树BoswelliacarteriiBirdw.或同属植物Boswelliabhaw-dajiana Birdw.树皮渗出的树脂。龙门米醋(批号20151126)，北京二商龙和食品有限公司；RS-Fluka(C8-C20，批号1443129)，德国SIGMA公司；乙酸辛酯对照品、α-蒎烯对照品(批号分别为111671-200602、897-200001)，中国食品药品检定研究院。

表1 乳香及醋乳香来源

GC-MS-QP2010型气相-质谱联用仪、Rxi-5 ms石英毛细管柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm)，日本岛津公司；98-1-B型电子调温电热套，天津市泰斯特仪器有限公司。

2 方法与结果

2.1 不同炮制方法醋乳香制备

取乳香分别在80 ℃温度下炮制20 min、25 min及30 min，在100 ℃温度下炮制3 min、4 min及8 min，120 ℃温度下炮制2 min、3 min及5 min，每100 kg乳香用米醋5 kg[7]。

2.2 挥发油的提取

称取市售乳香、醋乳香及不同炮制条件自制醋乳香各30 g，加10倍量水浸泡0.5 h，用水蒸汽蒸馏法提取挥发油6 h，经无水硫酸钠干燥后备用。所得挥发油为淡黄色透明油状物，具有特殊的浓郁香味。

2.3 GC-MS条件

GC条件：Restek Rxi-5 ms石英毛细管柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm)；进样口温度250 ℃；程序升温：起始温度50 ℃，保持1 min，以5 ℃/min程序升温至130 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min升温至230 ℃，保持3 min，进样量1 μL，分流比1∶60，载气氦气。MS条件：电离方式为电子轰击(electron impact，EI)，离子源温度200 ℃，接口温度为250 ℃，电子能量70 eV，电离电压0.78 kV，质量扫描范围45～450 amu。

2.4 分析测定

按上述GC-MS条件对市售乳香、醋乳香及不同炮制条件醋乳香挥发油进行分析，得其总离子流(total ion chromatogram，TIC)图(见图1)。

注：1.α-蒎烯；2.乙酸辛酯;A.α-蒎烯对照品；B.乙酸辛酯对照品；C.乳香供试品；D.醋乳香供试品

2.5 挥发油化学成分分析

对总离子流图中的各峰经质谱扫描后得到各组分的质谱图，经过质谱计算机数据系统检索(质谱数据库NIST05.LIB、NIST08.LIB、NIST05 S.LIB、NIST08 S.LIB、Wiley9.LIB)和人工谱图解析，保留指数(retention index，RI)是在相同条件下参考C8-C20正构烷烃混标测得[8]，进一步确定市售不同批次乳香及醋乳香挥发油中的化学成分，并采用面积归一化法计算。

2.5.1 市售乳香及醋乳香中挥发油主要成分对比研究 表2示，20批次市售乳香及醋乳香挥发油分别共鉴定出31个和33个成分，占色谱峰总数的93.94%和100%，可见乳香醋炙后有2个新成分产生，分别为ethlbenzene和α-侧柏烯。乳香和醋乳香共有成分为5个，10批乳香共有成分7个，分别为α-蒎烯、正辛醇、芳樟醇、乙酸辛酯、乙酸冰片酯、邻苯二甲酸二乙酯、黑松醇；10批醋乳香共有成分9个，分别为α-水芹烯、α-蒎烯、正辛醇、芳樟醇、trans,trans-3,5-heptadien-2-one、乙酸辛酯、乙酸冰片酯、醋酸正癸酯、邻苯二甲酸二乙酯。乳香醋炙后，有7个成分含量逐渐减低直至消失，分别为莰烯、benzene、1-methoxy-2-methyl、己基己酸酯、醋酸正葵酯、辛酸己酯和香树油烯。乳香在醋炙后有些挥发油成分相对含量增加或有新的成分产生，如α-侧柏烯在醋炙后产生，而另一些成分相对含量则减少，如α-蒎烯等。己酸乙酯、α-蒎烯、香柑油烯等在乳香中量较少，炮制后含量减少。乙酸冰片酯和乙酸辛酯2个成分含量在低温下随着炮制时间延长而增加，在高温下随着炮制时间延长而减少。

2.5.2 不同醋炙温度和时间对醋乳香挥发油成分的影响 取乳香100 g，采用2.1项下方法醋炙。考察不同炮制温度和时间对醋乳香挥发油成分的影响(见表2)。乳香挥发油得率为3.30%，在80 ℃温度下炮制20 min、25 min及30 min后挥发油得率分别为3.05%、2.97%及2.75%，在100 ℃下炮制3 min、4 min及8 min后挥发油得率分别为2.86%、2.72%及2.65%，在120 ℃温度下炮制2 min、3 min及5 min后挥发油得率分别为2.74%、2.53%和2.21%，表明挥发油得率在醋炙后减少，不同炮制条件醋乳香的挥发油得率证实了随着炮制温度的升高和时间的延长，挥发油得率逐渐减小。相同来源的乳香挥发油含量较醋乳香高。乳香和醋乳香的主要成分均为乙酸辛酯、正辛醇、α-蒎烯、柠檬烯，乳香中主要成分的相对含量范围分别为51.92%～79.59%、2.09%～13.50%、0.16%～3.73%、0.10%～1.82%，醋乳香中主要成分的相对含量范围分别为66.72%～80.94%、4.33%～12.2%、0.39%～2.43%、0.25%～4.15%。不同批次乳香挥发油化学成分种类及含量均存在一定差异，挥发油含量及其主成分相对含量也不同。乳香醋炙后，正辛醇与柠檬烯的含量逐渐增加，而乙酸辛酯与α-蒎烯含量逐渐降低。

表2 市售乳香、醋乳香及不同温度和不同时间下醋乳香挥发油成分及其相对含量比较

乳香醋炙后挥发油组成成分类别包括萜类、醇类以及有机酸类成分，每种类型成分个数不同，数量最多的为有机酸酯类成分(如图2)。研究表明，乳香经不同醋炙条件醋炙后萜类成分相对含量升高(从10.2%提升至14.8%)，而醇类(从5.6%降低至3.2%)和有机酸酯类(从80%至65.8%)相对含量降低。同一温度下随着炮制时间的延长萜类成分的相对含量增加，而醇类和有机酸酯类均降低。大部分成分随醋炙程度加深而含量增加(如图2)。

注：80-20为80℃温度下炮制20 min；120-5为100℃温度下炮制5 min

3 讨论

挥发油是乳香药效物质之一，约占3%～8%。现代研究表明，乳香挥发油具有抗炎、抗癌、阵痛、抑菌及促进中药成分经皮渗透的药理作用[9-15]。当前，研究者们从乳香挥发油中鉴定到340余种挥发性成分[16]。Anjanette等[17]通过对不同品种乳香水蒸气蒸馏法获得的挥发油进行成分分析发现，α-蒎烯、α-月桂烯、对伞花烯和柠檬烯是挥发油的主要成分，而其中α-蒎烯和α-月桂烯是区分不同品种乳香的标志性成分。而另外研究表明，3种不同用药品种的乳香中，B.dioscorides中含有丰富的单萜烃类化合物，主要成分为α-蒎烯和α-蒎烯，B.elongata中二萜含量以黄轮-4(20)-7,11-三烯、茚三酚和乙酸茚三酚含量最高。而B.socotrana以单萜(烃类和氧化类)为主，主要成分为对伞花烃、樟脑、萜烯-4-醇和2-羟基-5-甲氧基-苯乙酮[5]。2020版《中华人民共和国药典》中，以挥发油作为鉴定乳香的依据，其中埃塞俄比亚乳香主要考察乙酸辛酯的含量，索马里乳香主要考察α-蒎烯的含量[1]。本研究证实，20批乳香与醋乳香的主要成分均为乙酸辛酯、正辛醇、α-蒎烯、柠檬烯，而不同批次乳香挥发油化学成分种类及含量均存在一定差异，挥发油含量及其主要成分相对含量也不同。因此，除乙酸辛酯和α-蒎烯外，其余主要成分也可考虑作为乳香质量控制的指标性成分。

相关研究报道显示，乳香醋炙后胃肠刺激性减少，挥发油可能是刺激性成分的重要组成部分。有研究表明，乳香挥发油可对大鼠肝脏造成一定程度的损伤[18，19]。基于中医“扶正祛邪”等治则，有学者提出扶正祛邪炮制可纠正药物偏性并缓和药性[20，21]。乳香挥发油成分随炮制工艺条件的变化而改变，经不同醋炙条件醋炙后萜类成分相对含量升高，而醇类和有机酸酯类相对含量降低。同一温度下随着炮制时间的延长，萜类成分的相对含量增加，而醇类和有机酸酯类均降低。挥发油作为乳香三大功效成分之一，应进一步基于不同种类结构的挥发油成分的毒性加以深入研究，以规范其炮制工艺。本研究揭示了乳香醋炙前后挥发油成分变化，以及不同醋炙过程中温度和时间参数对挥发油的影响，为乳香的质量控制标准及炮制工艺的确定提供了一定的借鉴。