外泌体在心房颤动发生中的作用及其应用∗

陈慧宇 赵庆彦

外泌体是细胞外囊泡的一种,早期研究将外泌体作为细胞运输代谢废物的一种形式。目前的研究表明,在不同环境条件下,细胞分泌包含有各种信号因子(如DNA、RNA、细胞因子等)的外泌体,靶向作用于特定细胞,促进细胞间的信息交流[1]。前期研究显示外泌体与肿瘤发生密切相关,随着研究的不断进展,发现外泌体在心房颤动(简称房颤)发生机制中起着重要作用,有可能成为房颤诊疗的新靶点。笔者就外泌体与房颤的发生机制作一综述。

1 外泌体的来源及其作用

外泌体是一种细胞外囊泡,几乎所有的细胞均可分泌,存在于乳汁、唾液、尿液、脑脊液等多种体液中,其直径约40～160 nm。首先,细胞通过内吞作用形成杯状结构即内吞囊泡,后者包括细胞外环境中的可溶性蛋白及膜表面蛋白,参与早期核内体(ESEs)的产生,也可直接与已存在的ESEs融合。同时,粗面内质网、高尔基体和线粒体也参与了ESEs的形成[2]。随后在Rab蛋白的作用下ESEs成熟形成晚期核内体(LSEs),后者在核内体转运复合体(ESCRT)的作用下形成腔内小泡(ILVs)和多泡体(MVBs)。ESCRT 在这个过程中起着重要的分选作用,决定ILVs所运输的小分子物质的含量及其释放速率,使得最终生成的外泌体具有细胞特异性[3]。MVBs可在细胞质中被溶酶体或自噬体降解,也可以通过胞吐方式将ILVs释放到胞外形成外泌体[2]。

外泌体的细胞膜上含有丰富的跨膜蛋白,参与外泌体的合成、分选、释放、黏附、融合等多种生理过程。四跨膜蛋白(CD9,CD63,CD81)在外泌体中高度表达,参与外泌体的合成和运输。表皮生长因子受体(EGFRs)、上皮细胞黏附分子(Ep CAM)、整合蛋白、选择素以及CD40反映了外泌体细胞质膜的起源,是外泌体重要的生物学标志。此外,多种管腔蛋白在外泌体中发挥着各自不同的生理功能。TSG101,ALIX,Rabs,膜联蛋白有着特异性的膜受体结合能力,负责外泌体的合成及外泌体运载蛋白的筛选。细胞骨架蛋白(如肌动蛋白、微管蛋白、原肌球蛋白)、分子伴侣(如热休克蛋白HSP60)、多种代谢酶以及核糖体蛋白也存在于外泌体中[4]。根据来源的细胞所处的生理病理状态不同,外泌体运载不同种类的蛋白质、DNA、多种RNA,如信使RNA(m RNA)、长链非编码RNA(lncRNA)、微小RNA(microRNAs)、脂类以及生物活性分子等物质,这些小分子物质具有细胞特异性,通过内吞作用、膜融合、受体配体结合等方式靶向作用于受体细胞,调节细胞之间的信息交流[5]。外泌体存在于多种体液中,在肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病以及感染性疾病中发挥着重要的作用,有望成为疾病新型诊断指标和治疗靶点[6]。

2 不同来源的外泌体与心房重构和房颤诱发的关系

研究发现心脏中的多种细胞均可分泌外泌体,如心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、脂肪细胞、心脏祖细胞等[7]。一方面,外泌体在维持细胞的正常结构和功能方面发挥了重要作用;另一方面,在病理状态下,外泌体通过调节细胞间的信息交流从而调控基因表达,参与心房重构过程,诱导房颤的发生。下面讨论不同来源的外泌体在房颤发生机制中的作用。

2.1 脂肪组织 研究表明,心房纤维化是心房重构的重要标志,纤维化过程改变了心肌细胞间缝隙链接蛋白43(CX43)的生理特性,使其电阻抗增高,心房电传导速度降低,形成房颤发生和维持的结构基础[8]。脂肪组织作为多种炎性细胞和炎性因子趋化募集的重要“工厂”,在房颤心房纤维化重构和电重构的发生过程中占有重要地位。Pan等[9]研究发现小鼠脂肪组织来源的外泌体携带的miR-34a可靶向作用于转录调节因子KLF4抑制M2型巨噬细胞的极化,提高M1型巨噬细胞的活性。而M1 型巨噬细胞能促进脂肪细胞基质重塑,导致胶原蛋白的堆积和纤维化的形成[10]。研究发现房颤患者心房组织中促炎型M1型巨噬细胞增加,后者通过分泌IL-1β抑制心房肌细胞颤动蛋白(QKI)的表达,加剧心房电重构[11]。Shaihov-Teper等[12]收集32 例房颤患者和30 例非房颤患者心脏手术后的心外膜脂肪(EAT),分离纯化EAT 中的外泌体,分析了外泌体的数量、大小、形态、特异性标志物、运载的细胞因子、蛋白质组和微小核糖核苷酸,通过将外泌体与人心房间充质基质细胞和人脐静脉内皮细胞共培养、外泌体干预诱导人多能干细胞来源的心肌细胞的房颤模型、小鼠外泌体心室注射等方法,发现与来自非房颤患者的EAT 外泌体相比,来自房颤患者的EAT 外泌体对人心房间充质基质细胞和内皮细胞的增殖和迁移有更大的影响,房颤患者EAT 来源的外泌体能诱发心肌细胞房颤模型持续折返转子的形成。提示房颤患者的EAT 来源的外泌体具有独特的促炎、促纤维化和促心律失常的特征,揭示了EAT 是促进房颤发生的另一种途径。

2.2 成纤维细胞 成纤维细胞作为心房纤维化的重要参与者,其产生的外泌体miRNA 加速了心房纤维化的进程,提高了房颤的易感性。有研究显示在快速起搏1周犬的左心房成纤维细胞中,钙瞬时受体电位通道(TRPC3)蛋白表达明显增加,而miR-26表达下调。房颤诱导心房成纤维细胞的活化T 细胞核因子(NFAT)激活,经核定位及量化技术表明其5'启动子区域结合是miR-26的靶向结合位点,负向调节miR-26 的转录而增加TRPC3 通道的表达,从而促进TRPC3依赖的成纤维细胞增殖和分化,参与房颤的发生和维持[13]。Lyu等[14]研究表明AngⅡ能刺激心脏成纤维细胞产生外泌体,后者通过旁分泌效应作用于心肌细胞,提高心肌细胞表面AT1和AT2受体表达水平,增强了肾素-血管紧张素-醛固酮系统对心肌细胞的作用,从而促进了心肌细胞的肥大。Li等[15]研究发现肌成纤维细胞(myofibroblasts,MFB)来源的外泌体可以抑制心肌细胞中L 型钙离子通道(Cav1.2)的表达,将MFB 来源的外泌体与心肌细胞共培养,心肌细胞中的Cav1.2表达明显下调,此外MFB 源性外泌体能显著降低肾上腺素处理后的心肌细胞的钙离子内流信号,MFB外泌体中包含有miRNA-21-3p,一个潜在的Cav1.2抑制性miRNA,上调了心肌细胞对MFB 的反应性,进一步降低了心肌细胞Cav1.2的表达,增加了房颤的易感性。

2.3 心房肌细胞 心肌细胞来源的外泌体可通过miRNA调节靶细胞基因水平的表达,参与心脏微环境中的各种细胞活动[16]。Girmatsion等[17]研究发现miR-1在房颤患者心房组织中表达水平下降,其上调了钾离子通道蛋白亚基的表达,使得内向整流钾离子通道Ik1的表达增加,加速心房肌细胞的复极过程,可能与房颤电重构中心房有效不应期缩短有关。而Jia等[18]通过兔右心房快速起搏后,发现心房肌细胞miR-1表达升高,其靶向调节KCNE1和KCNB2下调,同时降低了心房有效不应期,心房IKs增加,由此表明miR-1在房颤的电重构中起重要作用。Lu等[19]研究来自房颤患者和犬房颤模型的心房组织,发现心房肌细胞中的miR-328能特异性地作用于Cav1.2基因CACNA1C,使Cav1.2表达水平下降,缩短动作电位时程,促进心房电重构的发生。Reilly等[20]研究发现miR-31在房颤患者心房肌细胞中特异性表达,并降低了房颤患者心房肌营养不良蛋白和神经源性一氧化氮合酶(n NOS)的含量,在房颤小鼠中,miR-31过表达或n NOS信号中断后,缩短了心房动作电位时程及其速率依赖性,导致心房表型改变诱发房颤。相比之下,在房颤患者心房肌细胞中沉默miR-31 可恢复肌营养不良蛋白和n NOS,并使动作电位持续时间及其速率依赖性正常化。研究表明在小鼠房颤模型组心房肌细胞miR-122的表达明显较对照组升高,miR-122抑制剂组较房颤组和对照组的细胞外信号调节激酶(ERK)/总ERK 比值显著增加,在抑制miR-122后,抗凋亡蛋白BCL-X 的表达显著降低,结果提示,miR-122可能参与房颤发生过程中心肌细胞增殖和凋亡分子机制[21]。Sun等[22]发现激活T 细胞核因子LncRNA非编码阻遏物NRON 的过表达抑制了来自心房肌细胞包含的miR-23a的外泌体表达,促进了巨噬细胞极化,减轻了心房纤维化。Lv等[23]建立大鼠房颤模型,发现心房过表达miR-27b-3p,后者可降低房颤的发生率和维持时间,减轻心房纤维化,增加心房CX43 的表达水平,降低胶原-Ⅰ、α-SMA、胶原-Ⅲ、TGF-β1、Wnt3a 和p-β-Catenin 的表达。MiR-27b-3p通过靶向作用于Wnt3a调控Wnt/β-Catenin信号通路,在心房纤维化和房颤的发生发展中发挥重要作用。

2.4 心包液 最近研究发现在房颤微环境刺激下,人心包液中包含的外泌体可影响心脏成纤维细胞和内皮细胞参与的纤维化过程。Liu等[24]收集9例成人先天性心脏疾病伴持续性房颤和窦性心律手术患者的心包液(pericardial fluid,PF)样本,通过生物信息学分析(简称生信分析)评估miRNA 的表达,结果显示miR-382-3p、miR-3126-5p 和miR-450a-2-3p参与心脏纤维化相关的KEGG 通路,如苏氨酸蛋白激酶(AKT1)/糖原合酶激酶-3p(GSK-3P)和TGF-β/MAPK1通路,在房颤进展中发挥潜在的作用。Liu等[25]采用GSE55296 数据集进行基因筛查,其中LncRNA 即AC022532.1、LINC00636和SNHG16 下调,生信分析显示,miR-450a-2-3p 是 LINC00636 的潜在靶基因,推测LINC00636/miR-450a-2-3p在房颤发生过程中有潜在功能。该研究组分别收集了12名房颤患者和非房颤患者PF中的外泌体,发现房颤患者PF 外泌体中LINC00636 和miR-450a2-3p的表达均低于非房颤患者组。将分离得到的PF外泌体和miR-450a-2-3p分别与成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞和大鼠原代内皮细胞共培养后发现,PF 外泌体LIN00636靶向调节miR-450a2-3p,后者抑制TGF-β1 诱导成纤维细胞的激活,同时也抑制了TGF-β1诱导的人脐静脉内皮细胞的内皮-间质纤维化过程,降低了纤维化程度,据此推测人心包液中的外泌体包含的LINC00636 靶向促进miR-450a-2-3p的表达,可能参与抑制房颤患者心房纤维化过程。

3 血浆外泌体可能成为房颤的临床生物学标志物

由于外泌体所包含的小分子物质可以反应其细胞来源,通过测定循环血液中不同类型的外泌体,可以作为生物学标志反映疾病早期的病理状态[6]。Su等[26]收集34例阵发性房颤患者和33例非阵发性房颤患者的外周血清标本,通过微阵列检测白细胞中的lncRNA 谱,发现在阵发性房颤患者和对照组之间分别发现了2 095个和1 584个差异表达的基因,通过生物信息(简称生信)分析(LncRNAs分类和亚组、基因本体分析、途径分析和基因共表达网络构建)结果表明阵发性房颤患者LncRNAENST00000559960 和LncRNAuc004aef3可能对房颤的发生有预测作用。Mun等[27]通过临床研究发现,相比于阵发性房颤和阵发性室上性心动过速患者,miR-107,miR-103a,miR-320d,miR-486和miR-let-7b在持续性房颤患者血浆中较窦性心律患者表达增加4.5倍以上,生信分析结果提示这些miRNA 可能与心房功能和结构信号通路有关,如心肌细胞中的缝隙链接、黏附连接和肾上腺素能信号;氧化应激信号,如MAPK、Wnt和缺氧诱导因子1在内的纤维化信号通路。

补体介导的炎症反应可能是导致房颤的另一个因素。Ni等[28]基于窦性心律和房颤患者血清蛋白组学分析,证实房颤患者血清外泌体的补体激活和蛋白质折叠改变;蛋白质二硫化物异构酶(PDI)、真核翻译延伸因子(eEF1A)和(脯氨酰顺反异构酶)Pin1表达参与蛋白质合成和折叠。房颤患者血清外泌体中PDI、eEF1A 和Pin1表达降低可能会破坏蛋白质平衡,加速氧化应激和活性氧的形成,这些同样也参与了房颤的发生发展。外泌体与房颤的发病机制和血栓形成风险增加有关,具有促炎和促血栓形成的特性[29]。研究表明单核巨噬细胞系可能是循环血液中携带组织因子(TF)的外泌体的主要来源,血小板、内皮细胞和中性粒细胞在一定条件下可产生携带TF的外泌体[30]。Chung等[31]报道房颤患者血浆中TF水平升高。携带TF、阴离子磷脂、尤其是外表面携带磷脂酰丝氨酸的外泌体是血栓形成的危险因素[32]。外泌体,尤其是miRNA,作为房颤的临床生物标志,可能有助于评估和划分风险,个体化治疗以及评估房颤患者的预后。识别可确定卒中风险房颤临床生物标志物将有助于指导血栓栓塞卒中高危房颤患者的抗凝治疗[33]。

4 外泌体在房颤治疗中的应用前景

外泌体有着较好的生物相容性、纳米级的直径以及独特的运输功能,可以运载药物、基因到体内发挥作用,因而外泌体可能成为比基于细胞治疗更有效的诊断和治疗方向[34]。目前外泌体已经应用于临床疾病的治疗,Alvarez-Erviti等[35]利用外泌体作为载体,修饰外源性短链干扰RNA 并靶向作用于小鼠大脑,证明了外泌体在神经退行性疾病治疗应用中的独特潜力。Hirai等[36]已将心肌球样细胞来源的外泌体miRNA 应用于小儿扩张性心肌病的心肌修复,并发挥了显著的治疗效果。将具有保护作用的外泌体应用于房颤的临床治疗可能成为房颤治疗的全新发展方向。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)、胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)以及心肌祖细胞(cardiac progenitor cells,CPCs)、心球样细胞(cardiosphere-derived cells,CDCs)可产生携带有不同类型的miRNA、蛋白质的外泌体,后者通过旁分泌、血液循环等途径作用于特定的靶细胞,在改善心功能、减轻心脏纤维化、减少心肌细胞凋亡、促进血管生成以及调节miRNA 的表达等方面起着重要的作用[37]。下面分别介绍上述细胞产生的外泌体在心房结构重构、电重构及氧化应激中的保护作用。

在缺氧条件下CPCs通过释放外泌体,抑制TGF-β促成纤维细胞活化效应,降低促纤维化基因的表达,并促进血管生成和心肌细胞的存活。将CPC来源的外泌体与内皮细胞共培养24 h后,内皮细胞中血管生成基因表达上调,明显促进内皮细胞管状结构的形成,CPC 外泌体增加梗死后心脏左室射血分数,明显减低了心脏梗死后的纤维化水平[38]。CDCs源性外泌体中的Y RNA 片段能调节IL-10的基因表达,经外泌体干预后的巨噬细胞能显著降低缺血再灌注心肌细胞的死亡率[39],而IL-10 是重要的心脏保护性细胞因子[40],将CDC源性外泌体的Y RNA 片段输注到心肌梗死的大鼠心脏中,心肌梗死的面积明显缩小,梗死区域内M1型巨噬细胞明显减少,凋亡心肌细胞明显减少[39]。MSCs产生的外泌体通过旁分泌作用调控钙离子操纵基因的表达、肌质网Ca2＋-ATP酶活性和心脏组织纤维化,建立人MSC-心肌细胞旁分泌模型和纤维化心脏组织模型,与对照组相比,蛋白质组学分析提示MSC 外泌体通过PI3K/AKT 信号途径使得心肌细胞在1 Hz起搏条件下产生的收缩力较对照组增加了4倍,在无成纤维细胞的模拟二维心脏单层组织中,人MSC 外泌体干预模型组,单个心肌细胞动作电位时程缩短,传导速度降低,至心律失常性增加[41],因而MSC 是否对纤维化心脏组织的致心律失常性有保护作用需要进一步研究加以验证。

研究发现将miR-320d模拟物转染骨髓间充质干细胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,AMSCs),将后者产生的外泌体与房颤心肌细胞共培养,结果显示,在AMSCs、外泌体和心肌细胞中的miR-320d水平明显增加,STAT3是miR-320d的直接靶基因,其在房颤心肌细胞中下调,心肌细胞凋亡明显减少,细胞活力增加[42]。Barile等[43]收集接受心脏手术患者心耳组织中CPCs和胸骨骨髓来源的间充质干细胞(BMCs)中的外泌体,分别将两者的外泌体与心肌细胞共培养,CPC外泌体比BMC 外泌体更有效地阻止星形孢菌素诱导的细胞凋亡,在大鼠心肌梗死模型中,CPC外泌体较BMC外泌体更有效地减小心肌瘢痕面,改善心室功能。蛋白质组学分析表明妊娠相关血浆蛋白A(PAPP-A)在CPCs分泌的外泌体中通过调节胰岛素样生长因子(IGF-1)的释放,使得Akt和细胞外活动调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)发生磷酸化,降低了凋亡蛋白酶caspase的活性,减少心肌细胞的凋亡。

上述外泌体可发挥逆转心律失常、抗纤维化、抑制心肌细胞凋亡等心脏保护效应,将这些保护性外泌体进一步应用于房颤的临床治疗可能成为新的研究方向。细胞分泌的外泌体经修饰后可产生补丁外泌体、基因工程外泌体、靶向外泌体以及干细胞源性外泌体,通过心脏补丁、心肌内注射、静脉/冠状动脉等途径特异性作用于心肌细胞用于心血管疾病的治疗[44],可以为外泌体在房颤中的研究提供切实可行的方案。通过设计基因工程外泌体/干细胞源性的外泌体,运载抗炎、抑制纤维化的蛋白质、药物等,靶向作用于受体细胞,抑制心脏成纤维细胞参与纤维化的病理过程,减少细胞外基质的堆积[45],进一步应用于抑制心房纤维化过程,有可能为抑制房颤心房重构提供新的研究思路。然而基于外泌体的治疗还存在有诸多挑战,一是外泌体的分离纯化技术还不够成熟,其生物学特性还存在一定的不稳定因素;二是外泌体运载机制尚未明确,而外泌体作用于受体细胞可能会带来其他潜在风险等,将外泌体应用于房颤的治疗需要进一步研究和探索。

5 小结

心脏不同类型细胞分泌的外泌体通过介导各种信号转导参与心房重构及炎症反应、氧化应激等病理过程,形成房颤发生的重要病理基质。血浆中特定外泌体水平可能反映房颤的病理状态,成为房颤临床生物学标志物。而来源于CPCs,ESCs,CDCs等细胞的外泌体在房颤中发挥着重要的抗炎、抗纤维化和心脏保护效应。通过基因工程技术设计特异性外泌体靶向作用于受体细胞,抑制心房重构,改善心房纤维化,调节K＋、Ca2＋等离子通道介导的心房电生理紊乱,可能成为房颤治疗的新方案。