对苯二胺荧光探针测定水质样品中的溶解态汞

余媛媛 肖 洁 方 超，2 李灵风 刘 玲，2 赵 海 李剑超

(1.湖北省地质局第六地质大队，湖北 孝感 432000；2.湖北楚鹏检测科技有限责任公司，湖北 孝感 432000)

汞是一种用途较广的重金属，以多种形态存在于环境中，其毒性大、易挥发，且具有生物蓄积性，在人体内达到一定浓度时，会致畸、致癌、致突变，危害人类的生殖和健康[1-2]，如日本著名的“水俣病”。因此，必须严格控制水体环境中汞的含量。我国《中华人民共和国环境保护法》中就要求生活饮用水中汞的含量不得高于0.001 mg/L。因此，发展高选择性、高灵敏度的汞离子检测方法对于环境监测、食品安全和人体健康至关重要。目前水质样品中微量汞的测定，主要包括分光光度法[3]、色谱法[4]、光谱法[5]、电化学分析法[6]、动力学传感器法[7]，这些传统的分析方法由于存在诸如分析流程繁琐、仪器成本较高、选择性不好及灵敏度不高等问题，在一定程度上限制了传统方法在汞离子检测方面的应用。与传统的汞离子检测方法[8-9]相比，荧光分子探针检测技术具有检测灵敏度高、选择性好、操作简便等优点，受到了人们的广泛关注[10-12]。

对苯二胺是典型的苯胺类化合物，其具有的特征官能团结构，在紫外区存在生色团，最大吸收波长为226 nm，并且在该波长下能发射荧光[13]，是一类光化学性能优良荧光染料，被广泛应用于合成染料和颜料，是重要的化工原料和中间体[14]。有文献[15]研究发现，铜离子能与对苯二胺发生络合，从而产生相应的激发峰与发射峰。但对苯二胺用于Hg(Ⅱ)荧光探针构建及识别与传感性能研究鲜见报道。本研究通过对苯二胺荧光特性的研究，确定缓冲体系的类型、pH值、浓度以及荧光探针的浓度等荧光探针实验条件，从方法的标准曲线线性范围、检出限、精密度、准确度等方面进行考察，尝试将所建立的实验方法应用于水质样品中溶解态汞的测定。

1 实验部分

1.1 对苯二胺荧光探针的设计思路

对苯二胺在226 nm波长激发光谱后，会发射出荧光，其最大发射波长为356 nm(见图1)。向对苯二胺溶液中加入Hg(Ⅱ)，对苯二胺的氨基向Hg(Ⅱ)提供配位的孤对电子，发生络合反应，当和Hg(Ⅱ)形成配位的对苯二胺受到激发后，由于电子跃迁的能量发生转移等原因，会产生荧光猝灭现象。基于对苯二胺的荧光猝灭程度与Hg(Ⅱ)浓度呈线性关系，可建立定量分析水质样品中溶解态汞的新方法(见图2)。

图1 对苯二胺的紫外吸收与荧光发射波谱Figure 1 The ultraviolet absorption and fluorescence spectrum of p-phenylenediamine.

图2 检测方法的原理示意图Figure 2 Schematic diagram of the principle of the detection method.

1.2 主要实验仪器及设备

LS55荧光分光光度计(Perkin Elmer)，HITACHI U-3010紫外可见光分光光度计(日本日立公司)，ZF-1三用紫外分析仪(北京启航博达科技有限公司)，PHS-3C型精密pH计(上海雷磁仪器厂)。

1.3 主要实验试剂及溶液的配制

对苯二胺、氢氧化钠、硼酸、硫酸汞(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)，磷酸氢二钠(分析纯，天津市天力化学试剂有限公司)，磷酸二氢钠(分析纯，天津市博迪化工有限公司)，冰醋酸、盐酸、磷酸、硫酸(分析纯，国药集团化学有限公司)，无水乙醇(分析纯，天津市北联精细化学品开发有限公司)。

探针标准溶液(10 μg/mL)的配制：称取0.010 0 g对苯二胺溶解并定容于10 mL的去离子水中，制得浓度为1 mg/mL的对苯二胺母液，取100 μL对苯二胺母液，定容于10 mL容量瓶中，摇匀，避光冷藏备用。

Hg(Ⅱ)标准溶液的配制(10 μg/mL)：称取0.014 8 g HgSO4并溶于10 mL的H2SO4(1+9)中，得到1 mg/mL的汞标准储备液，取100 μL汞标准储备液，定容至10 mL，摇匀，避光冷藏备用。其他金属离子标准溶液(铬、铅、镉、银、铜、铁、锌、钙、镁、钴、硒)的配制步骤同Hg(Ⅱ)标准溶液，摇匀，避光冷藏备用。

HAc-NaAc缓冲溶液(Acetic acid buffer solution，AABS)的配制：使用0.1 mol/L的NaOH溶液调节0.1 mol/L的HAc溶液的pH值，制得pH值为3.0～9.0的0.1 mol/L的AABS缓冲溶液，避光冷藏备用。

伯瑞坦-罗宾森缓冲液(Britton-Robinson buffer solution，BR)的配制：BR缓冲溶液由0.04 mol/L的H3PO4、H3BO3和CH3COOH配制而成，用HCl/NaOH调节pH值为1.8～11.9，避光冷藏备用。

Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液(Phosphate buffer solution，PBS)的配制：PBS缓冲溶液由0.1 mol/L的Na2HPO4和NaH2PO4配制而成，用HCl/NaOH调节pH值为6.5～9.0，避光冷藏备用。

1.4 荧光探针对苯二胺检测汞离子条件优化

1.4.1 选择性实验

在多支试管中分别加入150 μL探针标准溶液(10 μg/mL)和500 μL AABS缓冲溶液(pH=5.0)，分别加入一定体积不同金属离子标准溶液，去离子水定容，超声混匀，置于冰箱中避光冷藏1 h。检测体系荧光强度变化，探讨不同金属离子对探针荧光强度的影响。

1.4.2 缓冲体系的选择

在多支比色管中先分别加入不同pH值的PBS、AABS、BR 3种缓冲溶液，再加入1 mL探针标准溶液，去离子水定容，超声混匀，置于冰箱中避光冷藏1 h，检测溶液的荧光强度变化。探讨不同缓冲体系对探针荧光强度的影响，选择出最佳的缓冲体系。

1.4.3 AABS缓冲溶液pH值的优化

在多支比色管中分别加入1 mL不同pH值的0.1 mol/L AABS缓冲溶液，加入200 μL探针标准溶液和40 μL Hg(Ⅱ)标准溶液，去离子水定容，超声混匀，置于冰箱中避光冷藏1 h，检测溶液的荧光强度变化。考察pH值变化引发的测试体系相对荧光强度变化。

1.4.4 AABS缓冲溶液浓度的影响

在多支比色管中分别加入不同浓度(0～0.08 mol/L)的AABS缓冲溶液(pH=5.0)，加入200 μL探针标准溶液(10 μg/mL)和40 μL Hg(Ⅱ)标准溶液，去离子水定容，超声混匀，置于冰箱中避光冷藏1 h，检测溶液的荧光强度变化。探究不同浓度的AABS缓冲溶液对体系影响，确定其最佳浓度。

1.4.5 荧光探针(对苯二胺)浓度的影响

在多支比色管中均加入10 mL 0.010 mol/L AABS缓冲溶液(pH=5.0)和40 μL Hg(Ⅱ)标准溶液，然后分别加入不同体积的探针标准溶液，超声混匀，置于冰箱中避光冷藏1 h，检测其荧光强度变化，确定最佳的荧光探针浓度值。

2 结果与讨论

2.1 探针对Hg(Ⅱ)的选择性

对特定底物高选择性识别是探针优良性能之一，因此，首先考察了探针对Hg(Ⅱ)的选择性识别。如图3所示，Hg(Ⅱ)对探针荧光强度有显著的猝灭作用，而其他金属离子对探针荧光强度则无明显的猝灭作用。实验结果表明，探针可特异性识别Hg(Ⅱ)。

图3 常见金属离子对0.3 μg/mL对苯二胺荧光强度的影响Figure 3 The effect of common metal ion on the fluorescence intensity of 0.3 μg/mL p-phenylenediamine.

2.2 缓冲体系的选择

选择不同的缓冲体系对探针的荧光强度有较大的影响，如图4所示，在PBS、BR、AABS这3种缓冲溶液体系下，探针的最大荧光发射强度分别在250、500、950附近，探针在AABS缓冲体系下，可以获得相对最大的荧光强度，有利于提高本方法的灵敏度。实验结果表明，AABS缓冲溶液是较佳缓冲体系。

图4 缓冲体系的优化(a. PBS缓冲溶液；b. BR缓冲溶液；c. AABS缓冲溶液)Figure 4 The optimization of buffer.(a. The buffer of PBS；b. The buffer of BR；c. The buffer of AABS)

2.3 AABS缓冲体系pH值的优化

pH值对主客体相互作用起到至关重要作用，如图5所示，当pH<5时，随着pH值增大，Hg(Ⅱ)对探针荧光强度的猝灭作用不断增强，在pH=5.0时达到最大值，此后随着pH值继续增大，汞离子对探针荧光强度的猝灭作用不断减弱。当反应体系pH=5.0时，即有利于Hg(Ⅱ)的解离，也可避免过酸造成对苯二胺的水解，有助于荧光淬灭反应的发生。实验结果表明,pH=5.0是较佳的酸碱条件。

图5 AABS缓冲体系pH值的优化Figure 5 The pH optimization of buffer AABS.

2.4 AABS缓冲体系浓度的影响

在较佳的pH值条件下，考察了不同浓度的AABS缓冲溶液对反应体系的影响，结果如图6所示。结果表明,AABS缓冲溶液浓度为0.010 mol/L，汞离子对探针荧光强度的猝灭作用最强。因此，0.010 mol/L AABS缓冲溶液是较适宜的缓冲体系浓度。

图6 AABS缓冲体系浓度的优化Figure 6 The optimization of buffer concentration.

2.5 荧光探针(对苯二胺)浓度的影响

为了提高实验的灵敏度，考察了汞离子对不同浓度荧光探针的荧光淬灭作用，实验结果如图7所示，随着荧光探针的浓度提高，荧光淬灭的强度不断提升，当荧光探针的浓度达到0.40 μg/mL后，汞离子对荧光探针的猝灭效果开始趋于稳定并有缓慢下降的趋势。因此，0.40 μg/mL荧光探针溶液为较佳的底物浓度。

图7 对苯二胺浓度的优化Figure 7 The optimization of concentration of p-phenylenediamine.

3 荧光探针在实际水样中的应用

3.1 标准曲线及检出限

为验证探针对实际样品中汞离子检测的可行性，借助线性回归方程，测定水中可溶态汞。

取400 μL探针标准溶液于10.0 mL比色管中，加入500 μL AABS缓冲液(pH=5.0)，向上述溶液中加不同体积的Hg(Ⅱ)标准溶液，去离子水定容，测定标准曲线溶液荧光强度并绘制出标准曲线，见图8。结果表明，当Hg(Ⅱ)浓度在0.64～1.36 μg/mL范围内，荧光强度的猝灭与Hg(Ⅱ)浓度成良好的线性关系。线性方程为y=389.21x-218.62，相关系数为0.999 1。

图8 最佳条件下的标准曲线Figure 8 The standard curve under optimum conditions.

在选定的实验条件下连续测定多次样品空白，以3σ/k(式中：σ为样品空白标准偏差，k为校准曲线斜率)计算得到该方法的检出限(LOD)为0.032 μg/mL。

3.2 样品分析

在与标准曲线相同荧光探针实验条件下，对模拟样品(由Hg(Ⅱ)标准溶液配制)进行精密度实验，结果见表1。另外，在相同的实验条件下对三个实际水质样品进行加标回收实验，结果见表2。结果表明，该方法测定水中溶解态汞的相对标准偏差(RSD)为0.72%，加标回收率均在96.2%～105%，该方法具有较好的精密度、较低的检出限和较高的准确度。

表1 精密度实验结果

表2 实际样品加标回收实验结果

4 结论

基于对苯二胺的荧光猝灭程度与Hg(Ⅱ)浓度呈线性关系，建立定量分析水质样品中溶解态汞的新方法。在pH=5.0的0.010 mol/L AABS体系中，0.40 μg/mL对苯二胺荧光探针的荧光的猝灭程度与Hg(Ⅱ)的浓度在0.64～1.36 μg/mL有着良好的线性关系。与一些传统的测汞方法相比，该方法操作简便、灵敏度高、精密度好、成本低、对环境造成的污染较小，可有效地应用于实际环境水质样品中溶解态汞的检测。