金水六君煎含药血清对香烟烟雾及脂多糖诱导BEAS-2B细胞COPD黏液高分泌的影响*

张 钰 李福星 柳 卓 刘 雨△ 谭光波△

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南省中医研究院，湖南 长沙 412000；3.湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙 412000）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）简称慢阻肺，是一种常见的、可预防的疾病。据WHO预计，COPD将在2030年排名全球第3位死因［1］。慢性气道黏液高分泌（CMH）是COPD的重要病理生理特征和临床表现，近年来研究报道存在CMH的COPD患者在相同支气管扩张等药物维持下较其他类型患者急性加重更加频繁，肺功能下降更严重，生活质量严重下降，病死率更高［2-3］。

金水六君煎出自《景岳全书》，临床上治疗慢性支气管炎及COPD咳喘痰疗效满意，药效学研究证明能明显增加气管液体分泌量，促进痰液排出［4］。COPD黏液高分泌除黏蛋白的绝对量增多外，还与黏蛋白/水盐比例失衡有关［5-6］。前期研究表明，金水六君煎能通过下调黏蛋白MUC5AC抑制气道黏液高分泌［7］，然而对MUC5AC蛋白表达的调控机制尚未进一步探究。前期文献报道EFGR、VEGF蛋白可调控MUC5AC蛋白，从而改善COPD气道黏液高分泌［8-9］。本研究通过观察金水六君煎对体外人支气管上皮细胞BEAS-2B细胞黏蛋白MUC5AC、EGFR、VEGF表达的影响，探讨金水六君煎通过调控EGFR、VEGF蛋白治疗COPD气道黏液高分泌的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

实验细胞为BEAS-2B人支气管上皮细胞，购自北纳创联生物科技有限公司，细胞培养在湖南中医药研究院细胞实验室，培养箱条件为37℃，二氧化碳（CO2）浓度为5%。

1.2 实验动物

24只雄性SPF级SD大鼠，体质量（250±50）g，湖南省湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号SYXK（湘）2019-0004。饲养于温度23～26℃，相对湿度40%～70%，通风换气8～12次/h的环境。

1.3 实验药物

金水六君煎，药物组成：熟地黄15 g，当归6 g，半夏6 g，陈皮4.5 g，茯苓6 g，炙甘草3 g，生姜5片。中药饮片购自湖南省中医药研究院附属医院，加水煎煮制得生药质量浓度为1.5 g/mL的药液备用。

1.4 试剂及仪器

阿奇霉素（辉瑞制药有限公司，国药准字H10960112）；脂多糖（LPS）（碧云天，ST1470-10 mg）；常规化学试剂（上海国药）；还原型5XSDS上样缓冲液、1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8）、10%APS、10%SDS、TEMED、PBST 缓冲液、30%Acr/Bic、电泳液缓冲液、转膜缓冲液、10X丽春红染液、脱脂奶粉（Abiowell，货号AWB0004）；BSA（盐城赛宝）；RIPA裂解液（Abiowell，货号AWB0136）；蛋白酶抑制剂（北京金泰宏达，货号583794）；摇床；台式冷冻离心机（湖南湘仪）；电泳仪（北京六一）；电泳槽（北京六一）；转膜仪（北京六一）；旋涡混合器（江苏其林贝尔）；磁力搅拌器（雷磁）；普通冰箱（奥克斯）；电磁炉（荷兰飞利浦）；精密pH计（雷磁）；电子天平（美国双杰）；生物样品均质仪（杭州奥盛）；化学发光成像系统（勤翔）。

1.5 CSE和LPS的制备

1支香烟燃烧5 min的烟雾在注射器驱动吸引下溶于10 mL 37℃预热的PBS溶液中，调节pH至7.4左右，经0.22 μm滤膜过滤除菌后作为100%CSE原液，用无血清培养液稀释成不同浓度。CSE浓度（%）=CSE原液体积÷总体积×100%。LPS用PBS溶液进行溶解后，经0.22 μm滤膜过滤除菌后4℃备用。将脂多糖溶液按照20 ng/mL浓度配制，配制完成后搅拌摇动使液体均匀混合，过滤除菌并分装密封放置在-20℃条件下保存备用。使用前根据所需浓度用高糖型DMEM基础培养基稀释。

1.6 含药血清的制备

将SD大鼠随机适应性饲养5 d后随机分为空白组、金水六君煎低剂量组、金水六君煎中剂量组、金水六君煎高剂量组，各6只。金水六君煎方临床用量60 kg成人每日服用50.5 g生药，按临床等效量为中剂量，0.5倍等效量为低剂量，4倍等效量为高剂量。按体表面积转换为大鼠低、中、高剂量分别为2.63、5.26、21.04g/kg，即每日灌胃给药分别为1.75、3.5、14.03mL/kg，每天1次，灌胃前空腹6 h，连续5 d。无药血清组大鼠每日以3.5 mL/kg标准用生理盐水灌胃。于第5日最后1次灌胃后1 h，以3%戊巴比妥钠对SD大鼠腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，静置2 h凝固后，以2 000 r/min离心10 min，用移液枪吸取上层清液即血清，合并同组血清，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后，无菌试管分装，置于-20℃冰箱内保存备用，避免反复冻融。

1.7 细胞培养

人支气管上皮细胞（BEAS-2B）培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，37℃，5%CO2培养箱中培养，每1日换液1次，按1∶2比例传代。

1.8 细胞分组及干预

取对数期细胞进行实验，在T25培养瓶中加入DMEM培养基+10%FBS，37℃、5%CO2培养箱培养24 h至细胞贴壁。去原培养基，加入无血清DMEM培养基，37℃、5%CO2培养箱饥饿培养24 h。去原培养基，以培养瓶为单位，分为正常对照组（加入15%空白组大鼠血清）、模型组（加入15%空白组大鼠血清、10%CSE和20 ng/mL LPS）、金水六君煎组（加入10%、15%、20%金水六君煎含药血清、10%CSE和20 ng/mL LPS）、阿奇霉素组（25 mg/L阿奇霉素、10%CSE和20 ng/mL LPS），37℃、5%CO2培养24 h后收集细胞进行检测。

1.8.1 CCK-8法测定细胞活性 取对数生长期的BEAS-2B细胞稀释吹打成浓度为5×103/mL的单细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔细胞悬液量为100 μL，设立空白对照孔（加培养基100 μL），实验分正常组、模型组、金水六君煎组（10%、15%、20%）、阿奇霉素组，每组复孔数为6，各组细胞均在37℃，5%CO2环境下共同孵育24 h，按照试剂盒说明书，每孔加CCK-8溶液10 μL，温育2.5 h后，酶标仪测定450 nm波长处各孔的吸光度（OD值）。计算细胞存活率=100-（正常细胞组吸光值-加药组吸光值）÷（正常细胞组吸光值）×100%。显微镜下观察各组的细胞数目和形态。

1.8.2 Western blotting检测蛋白 将2～10代的人支气管上皮细胞分为正常组、模型组、金水六君煎组和阿奇霉素组，培养细胞覆盖T25培养瓶70%～80%时开始进行实验。模型组、金水六君煎组和阿奇霉素组给予含有LPS 20 ng/mL、10%CSE的细胞培养液培养，正常组给予正常细胞培养液培养。干预12 h后，金水六君煎组给予15%含金水六君煎大鼠血清，阿奇霉素组予阿奇霉素25 mg/L。12 h后进行蛋白表达测定。分别将4组细胞置于RIPA裂解缓冲液中裂解，于12 000×g（4℃）离心15 min，收集上清，用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。制备SDS-PAGE凝胶，后电泳转膜到NC膜上，封闭，孵育一抗和二抗。使用ECL化学发光液与膜孵育1 min，用滤纸吸尽液体，用塑封膜将膜包裹杂交膜，凝胶成像系统成像。

1.9 统计学处理

2 结 果

2.1 各组BEAS-2B细胞活性的比较

见图1，表1。与正常组比较，模型组细胞活性显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，含药血清组、阿奇霉素组细胞活性显著上升（P＜0.05）。3组含药血清组比较差异有统计学意义（P＜0.05），其中15%含药血清组较10%、20%含药血清组细胞活性显著上升（P＜0.05）。显微镜下观察各组细胞数目和形态：正常组贴壁后形态为梭形，细胞数目较多。模型组相较于正常组数目减少，形态大多数不规则。而3组含药血清组和阿奇霉素组相较于模型组，细胞数目多，且形态基本规则，其中15%含药血清组细胞数目最多，且形态较为规则。阿奇霉素组细胞数量虽较15%含药血清组多，但形态较为不规则。

表1 各组细胞活性比较（±s）

表1 各组细胞活性比较（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05；与正常组比较，△P＜0.05；与15%含药血清组比较，#P＜0.05。下同。

存活率（%）2.56±0.26 1.54±0.16△2.09±0.19*#2.69±0.22*1.80±0.21*#1.80±0.23*组别正常组模型组10%含药血清组15%含药血清组20%含药血清组阿奇霉素组n 6 6 6 6 6 6

图1 各组细胞形态学

2.2 各组BEAS-2B细胞MUC5AC蛋白表达的比较

见表2，图2。与正常组相比，模型组的MUC5AC蛋白水平显著升高（P＜0.05），提示模型造模成功。与模型组相比，金水六君煎组、阿奇霉素组可显著下调MUC5AC蛋白水平（P＜0.05）。与阿奇霉素组相比，金水六君煎组MUC5A蛋白水平相当（P＞0.05）。

表2 各组BEAS-2B细胞黏蛋白MUC5AC表达比较（±s）

表2 各组BEAS-2B细胞黏蛋白MUC5AC表达比较（±s）

组 别n MUC5A蛋白量相对表达正常组模型组金水六君煎组阿奇霉素组6 6 6 6 0.18±0.10 0.44±0.01△0.31±0.07*0.30±0.01*

图2 各组MUC5AC蛋白电泳条带

2.3 各组BEAS-2B细胞EGFR、VEGF蛋白表达的比较

见表3，图3。与正常组相比，模型组的EGFR、VEGF蛋白水平显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，金水六君煎组、阿奇霉素组可显著下调EGFR、VEGF蛋白水平（P＜0.05）。与阿奇霉素组相比，金水六君煎组EGFR、VEGF蛋白水平相当（P＞0.05）。

图3 各组EGFR、VEGF蛋白电泳条带

表3 各组BEAS-2B细胞黏蛋白EGFR、VEGF表达比较（±s）

表3 各组BEAS-2B细胞黏蛋白EGFR、VEGF表达比较（±s）

组别正常组模型组金水六君煎组阿奇霉素组n 6 6 6 6 VEGFA（45 kDa）0.17±0.04 0.39±0.08△0.24±0.04*0.25±0.01*VEGFA（25 kDa）0.16±0.01 0.37±0.04△0.23±0.01*0.26±0.01*EGFR 0.15±0.02 0.39±0.04△0.28±0.05*0.25±0.04*

3 讨论

近年研究认为气道黏液高分泌是影响COPD病情进展和病死率的独立危险因素［10］。近期有关文献报道，COPD临床表型为急性加重慢支气管炎型患者受气道黏液分泌增加影响更严重，使用常规药物维持后不能缓解［11］。中医学多将COPD归属为“肺胀”“喘证”范畴。“虚、痰、瘀”贯穿于COPD疾病始终。COPD气道黏液高分泌的中医药治疗以“脾为生痰之源，肺为贮痰之器”理论为指导。金水六君煎出自《景岳全书》，主治肺肾虚寒，水泛为痰，或外受风寒，咳嗽呕恶多痰，喘急等证，其中二陈汤理气燥湿化痰，当归、熟地黄滋肺肾阴血以治本［4，12-13］。药效学研究发现半夏提取物β-谷甾醇及金水六君煎可促进气管分泌，使痰液稀释有利于痰液排出［14］。前期研究发现金水六君煎明显提高COPD气道黏液高分泌大鼠模型CAMP含量及Na-KATP酶活性，抑制气道黏液高分泌［15］。

相关研究表明黏液糖蛋白是气道黏液的主要成分，主要由MUC基因编码，其中MUC5AC是气道上皮最重要的分泌型黏蛋白，其分泌机制涉及多个信号通路［16-18］。研究表明EGFR是受体酪氨酸激酶EerbB家族成员［5，19］，能够介导杯状细胞增生以及当气道受到IL-17、TNF-α炎性细胞刺激后，活化的EGFR将细胞外信号传到下游信号分子，导致MUC合成、分泌增加。且有研究发现选择性EGFR酪氨酸激酶抑制剂可以抑制杯状细胞增生，下调MUC5AC的表达［20］。VEGF为血管内皮生长因子，相关研究表明血管内皮生长因子可使MUC5AC上调［21］。

目前国内外同于构建体外COPD气道黏液高分泌的细胞模型主要人支气管上皮细胞BEAS-2B、癌细胞株NCI-H292、肺腺癌细胞株A549［22-23］。研究发现，构建COPD气道黏液高分泌细模型，人支气管上皮细胞BEAS-2B具有特异性［24］。香烟烟雾和脂多糖可诱导气道黏液高分泌，同时可使MUC5AC表达增高［25-26］。因此本研究采用香烟烟雾和脂多糖诱导BEAS-2B细胞建立体外COPD气道黏液高分泌模型。采用10%CSE和20 ng/mL诱导BEAS-2B细胞，同时用正常大鼠及含药血清干预24 h，结果模型组细胞活性较正常组显著降低，金水六君煎能够提升细胞活性。提示香烟烟雾以及LPS构建的模型细胞活性受损，金水六君煎可减少细胞损害。模型组MUC5AC蛋白表达较正常组均显著升高，提示香烟烟雾以及LPS诱导可成功建立COPD气道黏液高分泌细胞模型。与模型组比较，金水六君煎组能显著降低MUC5AC表达，提示金水六君煎在翻译水平抑制黏蛋白MUC5AC。模型组EGFR、VEGF蛋白表达较正常组均显著升高，与模型组比较，金水六君煎组能显著降低EGFR、VEGF蛋白表达，提示金水六君煎在翻译水平抑制EGFR、VEGF蛋白表达。本实验结果与文献报道一致，COPD气道黏液高分泌会出现EGFR、VEGF蛋白的高表达，而金水六君煎能够抑制EGFR、VEGF蛋白的表达［12-13］。

综上所述，金水六君煎可通过抑制MUC5AC、EGFR、VEGF蛋白表达改善香烟烟雾及脂多糖诱导的细胞的COPD黏液高分泌。由此推测，金水六君煎对MUC5AC蛋白的调控以及EGFR、VEGF蛋白调控呈正相关，为临床金水六君煎治疗COPD气道黏液高分泌提供了新的理论基础和思路。但金水六君煎调控黏蛋白MUC5AC与EGFR、VEGF蛋白的作用机制还需要进一步深入研究。