高迁移蛋白B1参与儿童癫痫发生机制及中医药干预进展

陈汉江， 张喜莲， 戎萍， 马融

癫痫发生(epiletogenesis)是指初始脑损伤后正常脑向慢性癫痫脑形成的过程，其定义强调了是一个慢性渐进过程[1]。一般分为初始脑损伤阶段、癫痫发生期、慢性癫痫期三期[2]。癫痫发生的狭义概念指癫痫发生期，而宏观概念指癫痫形成的整个过程，国际上更倾向于宏观概念的研究。癫痫发生是儿童癫痫的萌芽和前期阶段，而目前的抗癫痫药物都是抑制癫痫发作，尚无控制癫痫发生、阻断癫痫进程的药物[3]。癫痫发生的过程由多种病理生理改变参与，包括神经元细胞凋亡、胶质细胞增生、免疫炎症、突触可塑性改变及异常神经环路建立等[4]。其中免疫炎症反应受到业界广泛地重视。研究认为免疫炎症参与癫痫发生的全过程[5]。近期高迁移蛋白(high mobility group，HMG)B1在免疫炎症的独特地位以及儿童癫痫中的关键作用逐渐得到重视[6]，本文即以HMGB1在儿童癫痫的作用及中医药干预进行综述。

1 HMGB1的认识过程、家族、结构、功能及释放形式

1.1 HMGB1的认识过程 1973年英国学者Goodwin等[7]首次在牛胸腺中发现了一种30 kb的核内非组蛋白，因电荷丰富在凝胶电泳具有较快迁移速率被命名为高迁移率族蛋白。1999年Wang等[8]在《科学》杂志上首次阐述了HMG1在脓毒血症的作用，他通过对早期炎症因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1(iterleukin-1，IL-1)的干预发现并不能降低脓毒血症的预后，而抑制HMG1能显著降低死亡率，从而明确了HMG1的晚期炎症因子的地位。2001年Bustin[9]对HMG超家族进行了系统分类，根据功能的区别分为HMGA、HMGB、HMGN三大类，其中HMGB又分为HMGB1、HMGB2、HMGB3，其中HMGB1是含量最丰富的。随后关于HMGB1在重症医学、免疫学、肿瘤等领域得到广泛的研究。2010年意大利学者Maroso等[10]首次证实了HMGB1在癫痫中的促痫作用，并证实了HMGB1/Toll样受体-4(Toll like receptor 4，TLR4)通路是癫痫发生的关键靶标，阻断HMGB1/TLR4轴能降低癫痫大鼠的发作频率和缩短抽搐持续时间。自此以后近10年来在癫痫领域得到重视，相关论文在PUBMED中可检索多达百篇以上。

1.2 HMGB1的家族、结构 HMGB1是一种核蛋白，具有高度保守性，广泛存在于真核细胞内，隶属于HMG超家族。HMGB1在不同物种间进化高度保守，动物与人类的氨基酸同源性可达99%，大鼠与小鼠的氨基酸序列同源性可达100%[11]。HMGB1蛋白含有215个氨基酸，包括3个不同的功能区：两个DNA结合区(A-Box，B-Box)和一个C端负性调节区。HMGB1的分子活性主要由B-Box主导，具有诱发炎症反应或扩大炎症级效的功能，而A-Box则具有抑制炎症效应[12]。

1.3 HMGB1的功能 HMGB1根据其位置不同有两种不同的功能：(1)细胞内基因调控功能：HMGB1是核内结构蛋白，作为DNA的伴侣蛋白，与DNA非特异性结合，使DNA解螺旋，具有修饰、弯曲和改变DNA结构，参与DNA的重组修复，稳定染色质，基因的调控和转录[13]。(2)细胞外促炎功能：HMGB1主动或被动释放的方式由细胞内转胞进入细胞外。以“晚期炎症因子”的角色出现，不同于TNF、IL-1等早期炎症因子，它出现较晚且持续时间较长，成为晚期炎症的潜在干预靶点[14]。关于出现时间及持续时间研究，急性期癫痫模型在发作后12 h出现，能持续到72 h，而慢性癫痫模型发现在造模后7 d及14 d能检测到其表达。胞外HMGB1作用于神经元和胶质细胞，通过TLRS和晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products，RAGE)受体作用于核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)促进炎症释放，导致N-甲基-D-天冬氨酸受体-NR2B亚基(N-methyl-D-aspartic acid receptor-2B，NMDA-NR2B)磷酸化和谷氨酸蓄积，增强NMDA依赖性钙离子内流，促进癫痫发作[10]。

1.4 HMGB1的释放形式 HMGB1有被动释放和主动分泌两种形式，并且有病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMPs)和损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMPs)两种刺激模式[15]。(1)被动释放时，各种刺激导致神经细胞坏死及凋亡，细胞内HMGB1与DNA解离，以可溶物的方式释放到细胞外发挥促炎作用。(2)主动分泌时，由于细胞内HMGB1缺乏信号肽，不能由经典的内质网-高尔基体途径释放，一般通过细胞核到细胞浆，细胞器到细胞浆，胞吐释放到细胞外[16]。HMGB1主动分泌的生化机制有甲基化、丝氨酸磷酸化和乙酰化三种机制[17]。因此HMGB1的易位(translocation)及释放是研究的关键及可干预的靶点。

2 HMGB1参与癫痫发生的可能机制

一般情况下，PAMPs或DAMPs激活固有免疫细胞，引起固有或适应性免疫应答。HMGB1通过两个经典的转导通路激活下游免疫反应：HMGB1-RAGE轴和HMGB1-TLRs轴。

2.1 HMGB1-RAGE轴[18]RAGE称为晚期糖基化终末产物，是最早被发现的跨膜蛋白，HMGB1与RAGE通过静电结合，其下游通过胞内蛋白MAPK诱导NF-κB的转录，促进炎症的生成和释放，该通路被证实参与海马硬化、脑皮质发育不良及多重耐药等形成，尤其对多重耐药中P糖蛋白表达的研究较为集中[19]。

2.2 HMGB1-TLRs轴 TLRs是模式受体家族成员，目前被发现有13种之多，而TLR4是目前研究最多，认为是介导免疫炎症反应的关键受体，MyD88是HMGB1-TLRs信号通路的主要接头分子，MyD88通过与NF-κB促进炎症反应。研究发现，抑制HMGB1-TLR4信号通路能减轻癫痫小鼠发作严重程度和缩短惊厥时间，而在海人酸诱导C3H/He J小鼠(TLR4敲除小鼠)发现，在TLR4缺失的情况下，小鼠的发作次数和皮质脑电明显减少，提示HMGB1需通过TLR4发出信号[20]。HMGB1-TLR4调节轴与癫痫的发生和发作严重程度密切相关。阻断HMGB1-TLR4调节轴可以作为一种新的抗癫痫治疗策略。

3 中医药干预儿童癫痫发生机制

在中药干预HMGB1的研究中，基本分为中药复方和单体两种。他们都以HMGB1/TLR4/NF-κB的促炎通路为重点。作用机制基本包括分为抑制炎症细胞免疫反应、抑制胞内HMGB1的转位、抑制胞外HMGB1的过度表达和释放等三大类。

3.1 抑制免疫炎症细胞的活化及细胞保护HMGB1 作为体内重要的晚期炎症因子，介导晚期免疫炎症反应，参与适应性免疫应答。巨噬细胞(中枢神经系统为小胶质细胞)是体内主要免疫炎症细胞。小胶质细胞极化参与脓毒症相关性脑病，通过高通量测序技术观察强心一号复方[21](水红花子、黄芪等)能抑制海马区小胶质细胞向促炎型转化(标志物为HMGB1/TLR4)，减少脓毒症后海马区免疫炎症反应及炎症因子释放，减轻脑功能障碍。为明确抗炎合剂[22](生大黄、黄连、黄芩、厚朴及败酱草)减轻脓毒症急性肺损伤的分子机制，通过慢病毒载体构建稳定的过表达HMGB1和沉默HMGB1(HMGB1 RNAi)和RAW264.7巨噬细胞，分为空白组、脂多糖组及不同HMGB1+中药血清等7组，运用酶联免疫吸附和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)法检测发现不同表达方向HMGB1及TRL4、MyD88、NF-κB具有差异，HMGB1过表达可显著增强脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞系RAW264.7的炎症反应，抗炎合剂能够抑制该炎症反应。

3.2 抑制HMGB1 由胞内向胞外的移位HMGB1的胞外转位是其发挥促炎因子的关键。为了研究电针[23]“肝俞”和“阳陵泉”对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用以及对HMGB1的影响，采用经典无创动脉夹阻断肝缺血再灌注损伤模型，采用免疫组织化学、蛋白印迹法和聚合酶链式反应观察HMGB1的变化和细胞定位，肝俞-阳陵泉组较非经非穴组、模型组明显降低HMGB1、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)及TNF、IL-6的含量，考虑与肝俞-阳陵泉能抑制HMGB1从胞核向胞质的移位和释放，减轻肝脏缺血再关注损伤相关。而在另一项关于丹参多酚酸[24]改善缺血再灌注损伤的研究中，证实了丹参多酚酸不仅能抑制HMGB1的迁移、表达，还能抑制神经细胞凋亡，采用空白组、模型组、实验组和抑制剂组比较，采用经典中动脉栓塞模型，以神经功能缺损评分、WB、PCR等观察1 d、3 d及7 d的病理和蛋白表达情况，结果证实7 d实验组蛋白表达明显低于模型组及抑制剂组，考虑参多酚酸可以通过促进SIRT1转录、抑制HMGB1迁移和表达，减少下游通路的炎症因子P-53、NF-κB的释放，同时抑制神经细胞凋亡，其多功能考虑与中药的多靶点特性密切相关。

3.3 抑制胞外HMGB1的释放、迁移及表达胞外的HMGB1 作为一种晚期促炎因子发挥炎症介质功能。目前报道的大多数文献均抑制HMGB1的释放、迁移及表达为主，并且以HMGB1-RAGE/TLR4-NF-κB炎症信号通路为主。清脑通络方能通过HMGB1/TLR4抑制水通道蛋白-4(aquaporin-4,AQP4)表达和星形胶质细胞肿胀，减轻炎症水肿相关分子，加强内皮细胞紧密连接程度，改善血脑屏障功能[25]。其复方作用靶点可能是对信号通路蛋白均有影响，而非单一靶点。根据脓毒血症的关键在气营为理论依据，制定了清热化瘀通经的清气凉营汤[26]，以晚期关键炎症因子HMGB1、RAGE、CD4+、CD8+及急性生理与慢性健康(acute physiology and chronic health evaluation，APACHEⅡ)评分为核心指标，记录28 d死亡率，发现清气凉营汤能显著降低HMGB1、RAGE水平，调节CD4+、CD8+的表达水平，降低28 d病死率，考虑与清气凉营汤能降低HMGB1促炎因子的表达，促进自身免疫恢复稳态有关。在丹红注射液[27]对高脂血症合并脑缺血损伤的神经保护研究中，建立高脂血合并缺血再灌注模型，分为假手术组、模型组及丹红低中高剂量组，尾静脉注射7 d，采用尼氏染色、免疫组织化学、PCR等手段检测缺血侧脑皮质的病理、HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κB p65的变化，结果证实丹红组能显著降低上述蛋白的表达，并呈剂量依耐性。证实丹红注射液能减轻脑组织损伤，考虑可能与上调脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的表达及抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路激活有关。

3.4 中医药调节HMGB1干预癫痫发生的相关性研究 目前中药调节HMGB1的研究主要集中于脓毒血症、缺血再灌注损伤、神经保护等领域，并在近10年来逐渐引起了癫痫领域的重视。鉴于HMGB1在癫痫的认识刚刚兴起，中医药对HMGB1在癫痫发生的作用认识相对不够，部分文献将其列入一般性炎症指标，而未重点突出进行深入研究。以HMGB1为主要干预指标的文献相对较少，作者检测了近10年报道的中药干预HMGB1的文献，仅有甘草素、黄芩苷、小襞碱、抗痫增智颗粒、宁痫颗粒、乌灵胶囊等数篇文献。通过黄芩苷腹腔注射入匹罗卡品癫痫大鼠，观察(6 h、24 h、72 h、1个月)后大鼠的惊厥等级、病理、免疫组织化学，发现黄芩苷组具有显著差异，并且呈浓度依赖，能延长癫痫发作潜伏期和降低癫痫发作等级，提示黄芩苷对癫痫有修饰作用，可能与其对HMGB1/TLR4/NF-κB通路蛋白有调节作用[28]。以鹿茸、石菖蒲为君药的抗痫增智颗粒对癫痫神经保护的作用，以中药低中高剂量组与妥泰组进行比较，以苏木精-伊红染色、免疫组织化学、PCR及水迷宫检测为观察指标，发现抗痫增智颗粒能改善癫痫幼鼠的行为学与学习、记忆能力，保护神经元，其呈浓度依赖性，考虑与HMGB1/TLR4/NF-κB密切相关[29]。目前对HMGB1的研究相对较少，说明依旧有很大的空间，是未来拓展的方向。

4 讨论

癫痫发生是癫痫形成的萌芽期和前期阶段。着眼于癫痫发生的早期干预是癫痫防治策略前移的集中体现，也能较好地体现中医药“治未病”思想。神经元损伤和免疫炎症是癫痫发生的基本特征。免疫炎症贯穿于癫痫发生的全过程。HMGB1作为重要的晚期炎症因子是神经元损伤和免疫炎症的衔接因子，参与神经病理生化的进程，是干预儿童癫痫的关键靶点。其参与炎症过程中的胞内易位、胞外释放、启动下游免疫炎症几个关键环节都是可干预的靶标。该机制是区别于经典抗癫痫药物的离子通道阻滞、调节兴奋/抑制神经递质、结合突触小泡等机制。它以神经炎症为干预机制，具有抗癫痫和抑制癫痫发生的双重作用，有较广阔的前景。

鉴于HMGB1因子发现相对较晚，学术界完整地认识其结构和功能不足20年，被引入癫痫领域仅10余年，儿童癫痫领域认识更晚，因此仍有许多认识上的不足和需要拓展的方向：(1)进一步加强HMGB1在儿童癫痫领域的基础研究。需要进一步明确HGMB1的上下游、并行信号通路的相互机制或可能存在的正负反馈调节，以及与未成熟脑、发育期癫痫脑的内在联系。需要更多的高质量学术论著支撑，拓展该信号通路的深度和广度。(2)进一步加强中药干预HMGB1的精准化、物质基础及靶向性研究。中药具有多靶点、多成分干预的特点，该特点既是中药的优势，也是阻碍中药现代化的障碍。前期部分实验已经论证了中药单体及复方能对HMGB1的生成、转录及释放具有调节作用。但复方的成分多样性及药代动力学特点限制了中药的精准化和靶向性。明晰中药复方或单体的血清成分和通过血脑屏障的入脑成分，探讨中药干预儿童癫痫的成分-靶点-效应研究是未来中药的研究方向，目前新兴的网络药理学技术也为其提供了技术保障。