口腔内金属材料与微生物的相互作用及金属抑菌机制分析*

白 阳 贾顺义 李 楠

自1920年国际制定了银汞合金标准，医用金属材料在口腔中开始广泛应用，随着金属加工工艺和对医用金属研究的推进，口腔内金属材料的选择和应用范围不断拓展。主要应用于口腔的金属材料包括银汞合金、钴铬合金、镍铬合金、金-钯合金、银-钯合金、钛以及钛合金等，这些金属材料用于牙体充填，固定义齿及可摘局部义齿的制作，以及正畸相关配件和种植体各部件的合成。这些材料应用于口内，与口腔局部微环境发生相互作用，影响口腔疾病的发生、发展。

1.金属生物材料与口腔微生物的相互作用

1.1 传统口腔应用金属

1.1.1 非贵金属合金 银汞合金在其漫长的临床历史中不断发展，并以其良好的机械性能、较长的使用寿命和低成本被广泛应用。银汞合金主要由银、铜、锡、汞、锌组成，而这些金属离子具有良好的抗菌性。文献报道，银汞合金对变形链球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)和粘放线菌(Actinomycesviscosus)均有持久的抑制作用，而粘放线菌在生物膜的形成中起着关键作用[1]。Morrier等人通过测试变形链球菌和粘放线菌的悬浮液，证实了银汞合金中元素的抗菌活性顺序为Hg＞Cu＞Zn[2]，而在这些金属离子中，Cu2+和Zn2+对减少生物膜产酸具有协同作用[3]，因此银汞合金被证明具有抑菌杀菌的特性。由于银汞合金的抗菌性，继发龋发生率低，因此银汞合金在口腔中的寿命较长。然而，由于其细胞毒性、环境污染和不美观，银汞合金正逐步被淘汰。

钴铬合金是一种生物相容性、机械性和抗腐蚀性均较好的金属材料，合金成分主要由钴、铬、钼、钨组成。李洪洋等人的研究发现，钴铬合金烤瓷冠修复患牙12个月后，患牙龈沟液量、龈沟液中肿瘤坏死因子α水平及龈沟液中牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis，Pg)、福赛斯坦纳菌(Tannerella forsythensis，Tf)检出率均较修复前明显升高(P＜0.05)，但是伴放线放线杆菌(A.actinomycetemcomitans，Aa)的检出率无明显变化(P＞0.05)[4]。提示钴铬合金无抑菌作用。

镍铬合金的临床应用时间较长，不但具有良好的加工性能，而且与瓷有较好结合效果，但其耐腐蚀性能较差，易引起局部口腔病症。合金成分主要由镍、铬、镁、钼等元素组成。郭大伟等人[5]的实验研究发现，经镍铬烤瓷冠修复的牙齿，其龈下厌氧菌群在拆除烤瓷冠后越来越接近对侧同名牙，将其更换成金合金烤瓷冠后，也得到了同样的结果。吴婧婷[6]等人将镍铬合金、钴铬合金、金钯合金、金合金等放到同样的变形链球菌培养液中，结果显示，变形链球菌对镍铬合金的粘附率最高。虽然目前已知检测手段证明镍铬合金烤瓷冠的基底金属在临床应用的许可范围内，但是由于其耐腐蚀性差、易造成牙龈染色、过敏、导致口干症等问题，国内外已经很少使用。

钛及钛合金具有良好的生物相容性、耐腐蚀性和机械强度，满足骨修复材料的各项性能要求而且对人体无毒副作用，现已被广泛应用于口腔修复领域与口腔种植方向。合金成分主要由钛、铝、锡、钒、钼、铌等元素组成。纯钛对厌氧菌无明显的抵抗作用，易受细菌感染而导致种植体周围炎的发生，致使种植体松动脱落。目前，种植体表面改性是避免种植失败的主要方法之一，良好的种植体材料需要兼具抗菌活性和生物相容性，来提高种植体的长期在位率。

1.1.2 半贵金属 银-钯合金主要是由银、钯、金、铜等成分构成。它的抗氧化性、耐腐蚀性及生物相容性均优于非贵金属，银钯合金中含量最高的金属是银，Ag+具有强大的抑菌性已被广泛证实[7]，其对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有一定的抗菌作用，且对人体的细胞毒性远低于对细菌的毒性[8]。其价格也较金-钯合金有优势，在临床上有广泛的应用。

1.1.3 贵金属合金 金-钯合金是一种化学性能稳定，抗氧化且生物相容性良好的金属材料，主要由金、银、铜构成。金钯合金的腐蚀析出物多为非贵金属Cu2+，而Cu2+、Ag+等金属离子可以与细菌互相吸附，通过干扰细菌的酶系统，从而起到抑制细菌生长及粘附的作用[9]。另外这些金属离子也可以通过结合带负电荷的营养物质，来阻止细菌对这些营养物质成分的利用。另有研究证明，Cu2+的析出对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)和大肠杆菌(Escherichia coli)的繁殖有明显的抑制作用[10]。金-钯合金虽有如上诸多优点，但是由于其价格昂贵，临床上的使用有一定的局限。

九江市的山塘的主要功能是为农业提供水源，作为生活用水的山塘在数量较少，生活需水量不足山塘总用水量的1%，生态用水也只占总用水量的2%左右。

1.2 新型纳米金属 纳米颗粒是直径为纳米范围的超细颗粒，纳米技术使金属能够添加到纳米尺寸中，导致金属的化学、物理和光学性质发生极端变化。纳米金属颗粒因其良好的抗菌活性已被用做种植体表面改性的粒子涂层，可以有效地增加材料的抗菌性能[11]进而增强种植体的骨结合[12]。已有研究证实通过涂层或添加具有抗菌性能的金属纳米颗粒对钛种植体表面进行改性可以减少细菌数量，而且纳米粒子的直径更有利于成骨细胞的定植和随后的骨结合[13]。口腔金属材料中常用的纳米颗粒有如下几种。

1.2.1 纳米银颗粒 纳米银颗粒因其具有广谱、持久、强效的抗菌活性以及低细菌耐药性和低细胞毒性等特点，已在医学中得到广泛应用[14]。纳米银与其他物质的复合物也有抗菌作用，且具有良好的生物相容性，低毒性、离子长期释放和无细菌耐药等优点[15]。研究指出，纳米银粒子的抗菌活性是由于其对细菌细胞膜的损伤所致[16]。也有研究认为，其抗菌活性是银离子与酶的二硫键或氢键相互作用，导致代谢过程的中断，最终导致细胞死亡[17]。根据体内体外研究结果得出，纳米银颗粒可以抑制细菌附着在牙种植体上[18]。因此，纳米银颗粒有望成为一种广泛应用的种植体表面涂层。

1.2.2 氧化锌纳米颗粒 氧化锌纳米颗粒因其良好的生物相容性，被认为是一种在与人体接触界面上的适宜添加剂，氧化锌纳米颗粒对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及耐高温、高压的孢子都显示出抗菌活性[19]。其抗菌机理可能是过氧化氢的生成以及静电作用下氧化锌纳米颗粒在细菌表面的积累，也可能是纳米颗粒表面活性氧的产生、锌离子的释放、膜功能障碍以及纳米颗粒的内化等。Memarzadeh等人测试了一种含有氧化锌纳米颗粒和纳米羟基磷灰石混合物的系统，作为涂层材料，以减少细菌粘附和支持成骨细胞生长，笔者认为就抗菌活性和生物相容性而言，氧化锌纳米颗粒可以被认为是植入物的最佳涂层[20]材料。

1.2.3 氧化铜纳米颗粒Cu纳米粒子由于其独特的生物、化学和物理性质，抗菌作用以及低制备成本而备受关注。Cu纳米粒子具有很强的抗菌活性，然而暴露于空气中的Cu纳米颗粒的快速氧化限制了它的应用。而氧化铜纳米粒子是合适的替代品，已被报道为控制口腔内生物膜形成的潜在药剂[21]，研究人员认为，氧化铜纳米粒子通过穿过细菌细胞膜，破坏细菌的功能酶从而导致菌体死亡的途径起到抗菌作用。文献指出[22]，氧化铜纳米颗粒可穿过大多数细菌的细胞膜上存在的纳米孔来限制细菌生长。Anu等人[23]的研究结果还表明，纳米氧化铜可以作为一种钛种植体表面涂层，有效抑制植体周围的细菌生长和粘附。

2.金属生物材料与菌斑生物膜间的影响因素

金属生物材料在口腔中受到唾液、微生物、食物、温度波动和机械力等多种因素的影响。口腔中存在的复杂因素影响生物材料理化性质，显著降低其生物功能。与生物功能相关的最主要性能是金属生物材料的表面粗糙度、表面自由能、摩擦系数、腐蚀和生物腐蚀过程，这些因素会影响口腔生物膜的形成，从而导致口腔局部环境的改变。唾液作为微生物营养物质的转运体，在润滑和生物膜的形成中也起着重要的作用，而且可以和口腔中金属元素共同导致电解电池的形成，从而导致腐蚀和生物腐蚀。

2.1 作用介质--唾液 唾液在口腔中起着重要的作用，它创造了一个液体环境。其化学成分(有机和无机物质)赋予其润滑、缓冲和抗菌性能[24]。唾液中所含的黏液蛋白是维持体内平衡的重要成分之一，它具有粘附口腔黏膜的能力(所谓的黏液粘附)。因此，唾液覆盖牙齿、舌头、口腔黏膜和生物材料表面，形成获得性膜，厚度约为70-100μm[25]。

生物膜是一种由吸附的有机和无机唾液成分组成的表面膜，这些成分与细胞外聚合物质(EPS)中的微生物(细菌、真菌)定植在一起，覆盖口腔的所有表面[26]。生物膜的形成过程导致口腔参数的改变，如电解质浓度、p H值或氧水平[27]。唾液的流动也是影响生物膜数量和质量的重要因素。在唾液流动过程中，EPS成分会发生变化，这可能会影响生物膜表面的粘附性。生物材料暴露在高流量的唾液中(出现高剪切力)，不利于生物膜的形成[28]。

如前所述，唾液在控制生物膜的生长中起着重要的作用。由于疾病过程和药物使用导致其分泌减少，导致致病菌和真菌在口腔中不受控制地生长。这不仅会导致软组织发炎和增加龋病易感性，而且还会加速生物材料的磨损和腐蚀过程。具有适当成分的人工唾液可在防止这些过程中起主要作用，改进这类制剂的性能时应考虑到其化学改性。例如具有抗菌性能的生物活性化合物，能够防止细菌粘附在医用材料表面，继而形成菌斑生物膜。人工唾液成分的合理选择对金属生物材料表面生物膜形成的动力学和机理有潜在的影响。

2.2 表面粗糙度 关于口腔修复材料的众多研究显示，材料表面粗糙度高更加有利于口腔微生物的附着和聚集，进而更易于积累菌斑生物膜[29]。Ionescu等人认为，表面形貌，即表面波谷分布的三维特征，可以解释表面粗糙度(Surface Roughness，SR)在生物膜形成中的关键作用[30]。凹陷越深越大，接触面积越大，细菌的定植和生物膜的形成就越容易，且在细菌初始可逆结合过程中保护细菌不受剪切力(冲洗和冲刷)的影响，导致细菌不可逆的附着更加容易[31]。因此，粗糙表面上的微菌落难以消除，从而形成成熟的生物膜[32]。

口腔内的所有表面都被获得性膜覆盖，其存在在一定程度上抵消了SR[32]。此外，随着生物膜的成熟，SR对生物膜发育的影响减弱，新的细菌粘附在最初形成的生物膜上，而没有粘附在被测材料表面。因此，材料表面的粗糙度主要影响细菌的初始定植。有研究显示，当0.2≤Ra≤0.80μm时，粘附菌面积与SR呈高度线性相关(Ra称为轮廓算数平均偏差或称中心线平均值，是轮廓上各点高度在测量长度范围内的算数平均值，是表面粗糙度的一种计量单位)，当Ra≤0.20µm时，粘附菌面积与SR呈弱相关[33]。Lorenzo[34]揭示了由单一菌种或简单微生物组合形成的生物膜比由复杂群落形成的生物膜更容易受到表面粗糙度的影响。

2.3 表面自由能 表面自由能(Surface Free Energy，SFE)与材料表面润湿性有关，相当于材料表面的润湿性。为了确定SFE，测量不同疏水性的液体在同一材料表面上的接触角(θ)，接触角越小，SFE越高，表面亲水性越强[32]。口腔临床材料的参数对口腔生物膜的影响是复杂的和共同发生的。较高的表面亲水性意味着较高的SFE，从而导致更多的微生物聚集[32]。

研究表明当Ra＞0.1μm时，SFE对生物被膜形成的影响可能不准确，SR在生物膜积累中起主要作用，当Ra＜0.1μm时，SFE对生物被膜形成的影响更大。有报导称SFE影响了变形链球菌(S.mutans)在超光滑表面(Ra≤0.06µm)的早期粘附[33]。

2.4 腐蚀 金属生物材料的腐蚀是由于存在不同电化学电位的金属而导致的电解池形成和电流在口腔内流动的结果[35]。这种现象的发生取决于合金的类型、生产工艺流程、实验室处理(热、化学、机械)和口腔条件[36]。口腔中的唾液是一种电解质，在各种因素的作用下性质会发生变化，比如pH值的变化。在口腔中，除了唾液外，还有细胞外液(如血液、龈沟液)可以形成一个封闭的循环。因此，在口腔中，金属被淹没在两种不同的电解质中，这两种电解质含有同一种金属的不同浓度，会造成金属的腐蚀。

除口腔环境内的电化学诱导腐蚀外，金属材料表面生物膜的存在会显著增加腐蚀过程，这一过程也叫生物腐蚀[37]。在口腔环境中除了典型的口腔菌群外，还存在可诱导金属生物材料腐蚀的微生物。好氧微生物可促进各种氧化细胞的形成，从而加剧金属材料表面裂纹的出现。现有的生物腐蚀研究主要关注常规口腔细菌变形链球菌和血链球菌的影响。Souza的研究[38]中，在变形链球菌存在的情况下进行的电化学测试(钝化氧化钛膜的极化电阻)结果表明，这种细菌对钛合金的耐腐蚀性能有负面影响。Wilson[39]在诠释血链球菌引起腐蚀的观点中提出，金属表面细菌的存在会导致阴极/阳极区域，从而产生腐蚀电流，生成广泛的代谢产物，例如有机酸，可以直接与金属反应。无论是环境腐蚀还是生物腐蚀，均会影响金属修复体的机械完整性，导致松动并引起功能障碍，进而使金属材料与机体组织的生物相容性降低，加剧过敏[40]反应。

2.5 摩擦磨损 摩擦的定义是发生在两个相对运动表面之间并导致运动阻力的现象。摩擦导致材料的磨损，表现为接触面的质量、体积或厚度的损失。不同的运动过程，如咀嚼、吞咽和说话均在口腔中进行的。考虑到这一异质性现象，预测和预防牙齿和生物材料的磨损存在困难。

牙齿表面生物膜的存在可以显著减少生物材料与牙齿接触时的摩擦和磨损。口腔中的各种运动过程都是在唾液的存在下进行的，唾液是一种天然的润滑剂，可减少表面之间的摩擦，从而减少材料的磨损。Souza[41]研究了摩擦过程中被生物膜覆盖的钛的腐蚀情况，摩擦系数降低的同时，耐蚀性也有所降低。口腔中生物膜的存在，虽然通过降低摩擦能抑制腐蚀过程，但具有更大的形成腐蚀性微细胞的潜力，其促进腐蚀的作用更明显。腐蚀增加材料的表面粗糙度，口腔行使功能过程中的高剪切力，可能导致生物膜层的破裂，使被腐蚀的材料表面暴露出来，粗糙面的摩擦加速进一步磨损[27]。

3.金属元素抗菌机理

优秀医用金属材料的发展方向，抗菌性是必不可少的性能。多年研究与应用证实，许多金属与合金都具有强大的抗菌活性，例如，银及其合金、铜及其合金、氧化锌、氧化钛、镁等，但是它们的抗菌机理尚不明确。金属离子具有广泛的化学和物理性质，这些性质决定了它们的抗菌机制。目前国内外学者的研究发现可归纳如下几个方面：

3.1 破坏细胞膜完整性 金属离子和金属纳米离子与细菌细胞之间的第一个相互作用点是细菌细胞膜。细胞膜不仅是细胞与环境之间的主要屏障，还具有多种细胞生存所必需的功能，如电子传递链。细菌细胞壁为多层网状结构，主要由蛋白质、脂质和碳水化合物组成。根据细胞壁成分的不同，将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌和阴性菌的细胞膜是带负电的，抗菌性金属离子如银（Ag+）、锌（Zn2+）、和铜（Cu2+）等均带有正电荷，在近中性环境下，由于静电吸引和对硫蛋白的亲和力，金属离子会粘附在细菌细胞壁上，从而改变正常生物膜内外的极化状态，破坏细胞壁的磷脂双分子层，同时细胞膜的通透性会增强，并破坏细菌包膜导致细胞质渗出，引起细菌死亡。多篇文献指出[42，43]，抗菌金属对革兰氏阴性菌（如大肠杆菌）的抑制作用比革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）强，这可能是由于革兰氏阳性菌细胞壁具有厚的肽聚糖层，金属离子不易于破坏通过。

有研究表明[44]，金属纳米粒子由于其纳米级尺寸，还可以积聚在细胞壁的凹坑中，直接穿透细菌细胞膜并随后改变膜结构。Alsammarraie等人[45]通过透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)研究了用银纳米粒子处理后细菌细胞形态的变化，未经处理的细胞具有光滑和规则的细胞壁，细胞质均匀，但暴露于银纳米粒子的细胞壁明显收缩和损伤，细菌细胞内容物渗漏或丢失。由于纳米材料的尺寸较小，具有较高的表面积与体积比，使得它们比块状材料抗菌性更强，并能在低浓度下保持一定的抗菌性。

3.2 影响蛋白质功能 影响蛋白质功能研究表明[46]，细胞内蛋白质中氨基酸上有金属离子的结合位点，主要由半胱氨酸侧链上的还原硫醇、天冬氨酸和谷氨酸的羧基以及赖氨酸侧链上的高活性伯胺组成。结合后，金属离子会催化氨基酸的氧化，削弱蛋白质的功能，降低蛋白质的稳定性，并促进蛋白质的降解。此外，许多蛋白质的正常折叠和生物学功能都需要金属辅因子[47]。半胱氨酸在生物反应中非常重要，因为它的二硫键对于蛋白质的正确折叠和功能以及它在催化反应中的亲核作用都是至关重要的，当将半胱氨酸加入到Ag+和细菌的混合物中时，Ag+的抗菌活性被中和，表明Ag+与硫醇基团相互作用，从而可抑制细菌生物反应[48]。Mukha等[49]研究发现，蛋白质与纳米银在甘露糖磷酸异构酶的SH基团中相互作用，导致细胞壁合成中断，并致使细菌内部成分的渗出和细菌死亡。暴露于细菌细胞的金属纳米粒子已被证明会引起蛋白质组谱的变化，Leung等人[50]用氧化镁纳米粒子处理大肠杆菌，发现菌体109种蛋白质被调节，其中83种被下调，这些蛋白质参与中枢代谢、遗传信息转录和其他对细胞功能至关重要的过程。

3.3 促进活性氧的产生 活性氧（ROS）是一种高活性的氧，如过氧化物、超氧化物、羟基自由基和单线态氧。在基础代谢过程中产生，动态平衡期间ROS水平一定，过量的ROS被细胞内的抗氧化防御系统清除，然而，当ROS产生和抗氧化防御之间的平衡被破坏时，ROS浓度会逐渐增加，并对细菌蛋白质、DNA和脂质造成严重损害，从而影响细菌代谢过程、DNA复制和细胞分裂，形成氧化应激，导致菌体死亡[51-53]。

Zn2+、Ag+和Cu2+等金属离子可通过催化反应激活水和空气中的氧，产生ROS；一些金属氧化物如TiO2、ZnO，也可以通过可见光或紫外光的催化，产生高水平ROS，从而表现出抗菌活性。

由于细菌细胞膜具有脂质结构，活性氧可以通过氧化脂质破坏细胞膜，但是只有带正电的H2O2能够穿过细菌细胞膜，超氧化物和羟基自由基带有负电荷，不能渗透到膜中。当然，具有较厚细胞壁的革兰氏阳性细菌也无法轻易穿透。Ramalingam等人[54]提出了银纳米粒子的双峰作用机制。第一步，破坏并穿透细胞壁，第二步，形成ROS，抑制ATP产生和DNA复制。由于在上两段中已经证明细胞内ROS的产生抑制了细菌内部抗氧化防御并对膜施加了机械损伤，因此ROS的产生也可能在第一步中起作用。

3.4 改变p H值 细菌通常在pH值为6.0-8.0的环境中存活，而p H过高或过低都不适合细菌的生存，因此，一些可生物降解的金属表现出强大的抗菌活性。镁和镁合金在生理水溶液中的主要可溶性降解产物是镁离子和氢氧根离子，当镁合金快速降解时，产生的氢氧化镁会导致溶液pH值增加，可以达到11.0甚至更高。在Qin[55]的研究中，Mg的抗菌作用随降解时间的延长而增加，这表明Mg的抗菌活性与pH值成正比。Ma等人[56]研究制备了掺镁支架材料PLGA/Mg，PLGA/Mg组的p H值在48 h内高于PLGA，并且具有较高Mg含量的PLGA/20%Mg支架比PLGA/10%Mg支架导致更高的pH值。抑菌试验结果表明，PLGA/Mg支架在24 h和48 h均能抑制细菌生长和生物膜形成，且抑制作用在Mg含量较高的组中更为明显。文献指出[57]，镁的抑菌作用来源于碱性环境与Mg2+的协同作用。

金属及其合金并不是通过单一的机制来产生抗菌作用，往往是多个且相互关联的作用机制叠加的复杂结果，目前研究给出的最为可能的机制是，金属离子或金属纳米粒子从金属中释放出来，通过静电作用、范德华力、受体-配体或疏水作用附着在细菌细胞膜上，并穿透细胞膜，导致膜形态和功能受损，使细胞内容物外泄，金属离子或纳米粒子一旦进入细胞，可直接干扰蛋白质和DNA功能及细胞代谢，并改变基因表达水平。同时，细胞外和细胞内ROS的形成，也会对脂质、蛋白质和DNA进行破坏，导致细菌细胞损伤或细胞死亡[58]。

4.总结

金属材料进入口腔，在复杂的口腔环境影响下与微生物相互作用，并进一步对修复体的生物功能和局部感染性病损产生影响。口腔感染性疾病包括龋齿、牙周炎、口腔黏膜病、种植体周围炎等，这些疾病都是菌斑生物膜形成、累积，达到临界值时造成的不可逆病损。随着抗生素耐药菌株的影响越来越大，迫切需要有效且长效的抗菌材料。金属材料参与口腔疾病治疗的同时，应用与研究的发展对金属材料的全面性能要求越来越高，不仅应具有良好的理化性能，加工性能，生物相容性，还必须具有良好的抗菌性能。几个世纪以来，人们一直在使用金属，并对其抗菌性能进行了广泛的研究。抗菌金属和合金的强而长期的抗菌能力以及良好的耐腐蚀性和机械性能都证明了抗菌金属材料在未来的应用潜能。抗菌金属可用于制造修复治疗中的可摘义齿支架、冠桥修复体的内冠、牙种植体、正畸托槽或这些金属表面的抗菌涂层，在牙体、牙髓治疗中的冲洗液和充填材料，以及牙周引导组织再生膜中等等，应用或添加抗菌金属，均具有广阔的临床应用和研究前景。