基于GEO数据库的产后抑郁症关键差异表达基因分析

贾 颖，卓 频，赵 爽，胡文燕

天津倍科为医学检验实验室，天津 301799

产后抑郁症(PPD)是指女性在产褥期发生的一种严重的情绪障碍疾病，其临床发病率为10%～15%[1-2]。其症状包括负面情绪(如悲伤、焦虑、绝望等)，思维迟缓，睡眠障碍，精力不足，迫害妄想，甚至出现伤害婴儿或自杀行为等[1]。PPD不仅严重影响产褥期女性的健康，同时还会损害正常的母婴关系，影响到后代的正常生长发育[2]。

研究表明，免疫系统参与了重性情绪障碍疾病的发生发展。对于产褥期女性而言，从妊娠期到产褥期的过渡伴随着复杂的免疫适应性调节反应[3]，产后阶段的特征是细胞因子水平升高，免疫细胞浸润增多[4-5]，与妊娠晚期相比，产褥期T调节细胞(Treg细胞)亚群显著增加[5]。PPD的病理生理机制复杂，免疫调节功能障碍可能与PPD的发生发展有关。尽管有研究表明，抗/促炎细胞因子白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8、IL-10、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、C反应蛋白和皮质醇等可以作为PPD外周血生物标志物[6]，还有研究表明，PPD的发生与雌激素受体α基因(ESR1)、5-羟色胺转运蛋白(5-HTT)等基因表达有关[4]，但PPD与免疫相关的病理生理机制仍不清楚，还需要进行更多深入的系统研究。

近年来，基因测序技术与生物信息学分析相结合的研究策略为从分子水平识别生物标志物和理解精神障碍疾病的病理生理学基础提供了强有力的工具[7]，本研究旨在利用生物信息学分析方法从PPD患者的转录本表达层面来探明产褥期女性体内可能发生的与PPD相关的免疫相关基因网络与生物学变化，并寻找外周血中PPD潜在的生物标志物，以期为阐明PPD的疾病生理机制提供新的线索。

1 材料与方法

1.1材料来源 登录NCBI的GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，选择GEO Data Sets，输入“postpartum depression”检索相关数据，根据研究样本及类别筛选出符合条件的芯片。选取编号为GSE45603的芯片数据及其注释文件进行下载(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE45603)。数据来自GPL10558 Illumina Human HT-12V4.0 expression bead chip。选取GSE45603中的16例产褥期PPD患者样本以及5例健康对照样本进行分析。

1.2筛选差异表达基因 利用R语言(V3.6.2)对原始基因进行二次分析，选取limma包对芯片数据的差异表达基因进行分析，为了得到更多的差异表达基因，将显著差异表达基因的筛选条件设定为P<0.05，差异倍数|logFC|>0.5，其中，logFC>0.5的基因作为上调基因，logFC<-0.5的基因作为下调基因，得到差异表达基因文件后运用plot包绘制火山图。

1.3差异表达基因的功能富集分析 利用metaspace软件对筛选出的差异表达基因进行基因注释，并进行基因本体论(GO)中的生物学过程和代谢通路的功能富集分析。选取注释到GO功能富集的前10位进行柱状图展示，选取注释到代谢通路富集的前10位进行气泡图展示。

1.4构建差异表达基因编码的蛋白质-蛋白质互作(PPI)网络及筛选关键基因 通过metaspace软件对差异表达基因进行PPI网络图分析，按照默认参数值(physical score > 0.132，STRING)筛选出互作蛋白对。先将所有的差异表达基因进行相互作用网络分析，之后采用MCODE算法识别蛋白质紧密相连的邻近区域，将网络进行聚类，对得到的差异表达基因进行注释，并选取校正后P值最小的前3位代谢通路放入列表进行展示。根据PPI网络聚类中差异表达基因的得分值(Cluster-Score>1)筛选参与免疫相关生物学过程及代谢通路的核心关键基因。

2 结 果

2.1差异表达基因的筛选 获得了714个差异表达基因(图1)，包括149个上调基因及565个下调基因。

注：浅灰色部分为上调基因，黑色部分为下调基因。

2.2差异表达基因的GO功能富集分析和代谢通路富集分析 应用metaspace软件对得到的差异表达基因进行GO功能富集分析(图2)和代谢通路富集分析(图3)。GO功能富集分析结果表明，差异表达基因主要集中在细胞因子产生的正向调节、树突状细胞分化的调节、树突状细胞分化、适应性免疫反应的调节、前体代谢物和能量的产生、免疫效应过程、参与免疫反应的白细胞激活、白细胞介导的免疫调节、白细胞分化、T细胞活化等生物学过程中。代谢通路分析结果表明，差异表达基因在中性粒细胞脱粒、适应性免疫系统、淋巴细胞和非淋巴细胞之间的免疫调节相互作用，抗原加工和呈递等通路中显著富集。

图2 GO功能富集(前10位)

图3 代谢通路富集(前10位)

2.3差异表达基因的关键MCODE模块及关键差异表达基因筛选 分析得到4个关键MCODE模块及其对应的功能与代谢通路信息(表1)。根据PPI网络聚类中差异表达基因的得分值(Cluster-Score>1)筛选出11个参与免疫相关生物学过程及代谢通路的关键差异表达基因，其中，CD3G、CD8A、CD8B、ABL1、CCR7、CXCR6表达显著上调(P<0.05，logFC>0.5)，而HLA-G、HLA-C、CCR1、SSTR2、LPAR2表达显著下调(P<0.05，logFC<-0.5)。

表1 差异表达基因PPI网络图对应注释信息

3 讨 论

PPD是产褥期女性常见的精神系统疾病，其发病率呈现不断上升趋势。PPD的发病因素多样，与产褥期女性的遗传、心理、社会、生理以及免疫等因素相关，会给个人、新生儿以及家庭和社会带来一系列不良后果[2]。随着国家二孩、三孩政策的实行，妊娠期产褥期女性越来越多，为防止更多的产褥期女性发展成为PPD，及时的诊断和干预十分重要。

从生物因素的角度，目前已有研究揭示了PPD与女性产褥期激素异常波动以及体内产生的应激反应导致的免疫系统功能障碍有关[3]，但是未阐明PPD的具体发病机制，还需要更多更深入的研究进行分析。

本研究对得到的差异表达基因进行GO功能富集分析并构建PPI网络，结果显示，PPD患者体内免疫功能失调，白细胞、T细胞活化，树突状细胞成熟，适应性免疫系统增强，但抗原呈递功能减弱。有研究指出，抑郁症患者体内免疫功能障碍的来源可能与感染、微生物组的改变、疾病、压力和其他因素相关[6]，本研究显示，PPD患者体内细胞因子产生的正向调节活动增强，提示患者体内炎症反应增强，其可能来源于患者产褥期虚弱、经受病原微生物感染或其他压力性因素。

对于得到的11个关键的差异表达基因，研究表明，CD3G是CD3分子的一种亚型，CD3分子在转导T细胞受体(TCR)识别抗原所产生的活化信号中起重要作用[8]；CD8+T细胞主要参与抗病毒免疫、抗肿瘤免疫及移植排斥反应。CD8分子主要表达于细胞毒性T细胞表面，能与MHCⅠ类抗原结合，增强TCR识别靶细胞(如病毒感染细胞、肿瘤细胞等)表面的p-MHCⅠ类分子复合物。CD4与CD8分子比例下降提示免疫系统受到损伤[9]。邬贤凤等[10]的研究结果显示，PPD患者CD3、CD4表达水平显著下降，而CD8表达水平显著上升，同时相关性分析结果显示，PPD与CD3、CD4表达水平及CD4/CD8呈负相关，而与CD8表达水平呈正相关。该结果与本研究中CD8基因表达显著上调结果一致，提示PPD患者体内T细胞免疫功能下调。ABL1蛋白主要参与细胞的分化、分裂与应激反应等，ABL1蛋白的SH3结构域的缺失会使ABL1成为原癌基因，从而导致细胞发生癌变。HLA-G与HLA-C均属于非经典HLA-Ⅰ类分子，有研究报道HLA基因的下调可能导致抗原提呈减少，从而促进肿瘤免疫逃逸[11]。也有研究表明，一些病毒，如EB病毒(EBV)可以通过抑制抗原提呈而有效逃避免疫系统细胞毒性T细胞的识别，避免免疫系统的监视[12]。CCR7基因编码的蛋白质是G蛋白偶联受体家族的成员，该受体被认为是EBV感染B细胞的介质[13]，在各种淋巴组织中表达并激活B和T细胞，可以控制记忆T细胞向炎症组织的迁移，并刺激树突状细胞成熟。趋化因子CCR1及其受体介导的信号转导对于效应免疫细胞招募到炎症部位至关重要，与多种人类疾病有关，包括类风湿关节炎、多发性硬化、多发性骨髓瘤和相关的溶骨性疾病[14]。研究显示，CCR1持续表达于嗜中性粒细胞、单核细胞、T和B细胞等免疫细胞表面[15]。CXCR6主要在几个T细胞亚群和骨髓基质细胞中表达，参与调节T细胞向各种外周器官组织(肝、脾红髓、肠、肺和皮肤)迁移的信号通路，并促进细胞与树突状细胞和成纤维细胞网状细胞的相互作用[16]。本研究中CCR7与CXCR6表达上调，而CCR1表达下调，提示PPD患者体内可能存在由于病毒感染引起的炎症反应。SSTR2可介导生长抑素的释放，从而抑制内皮细胞增殖以及诱导细胞凋亡，此外，SSTR2参与机体内抗肿瘤反应，其低表达有可能促进肿瘤细胞增殖、迁移作用[17]。LPAR2蛋白作为溶血磷脂酸(LPA)受体，可能在LPA促进肿瘤细胞迁移的过程中起主要作用[18]。本研究中，SSTR2和LAPR2显著下调，表明PPD患者体内免疫功能低下。鉴于EBV是一种人群易感病毒，感染率高达90%，而在PPD患者体内可能存在EBV逃逸免疫识别，同时增殖活化T细胞，引起免疫系统损伤的路径，进而导致PPD的发生，但还需更多研究来证明该机制的可能性。

本研究通过分析GEO数据库中的GSE45603芯片数据，得到与免疫相关的4个关键MCODE模块以及11个关键差异表达基因，这11个关键差异表达基因可作为PPD早期检测的潜在分子标志物。此外，本研究从分子功能与生物过程及代谢通路的角度进一步阐述了PPD可能的发病机制，为PPD的发生发展寻找新的作用靶点提供了新的思路。但是PPD的病理生理机制复杂，本研究仅关注PPD与免疫相关的差异表达基因及其代谢通路，研究结果还需要进一步的临床试验进行验证。