一株高效降解呕吐毒素的德沃斯氏菌筛选鉴定及效果评价

孙 晶, 杜 稳, 赵程程, 常晓娇, 赵一凡, 王 峻, 刘虎军

(国家粮食和物资储备局科学研究院，北京 100037)

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)，又名呕吐毒素，20世纪70年代由Yoshizawa等在被镰刀菌污染的小麦等谷物食品中发现并鉴定[1]，DON属于单端孢霉烯B族化合物，化学名称为3ɑ，7ɑ，15-三羟基-12，13-环氧单端胞霉-9-烯-8-酮，分子式C15H20O6。DON污染在霉变的玉米、小麦等谷物中较为普遍，是导致食品安全问题的主要真菌毒素之一[2-4]。该毒素进入食物链后可引起人畜多种疾病，导致人和动物的细胞毒性[5,6]、免疫毒性[7,8]、肠道毒性[9,10]、神经毒性[11]和生殖遗传毒性[12]，禽畜采食污染的饲料后，会出现拒食、呕吐和引发流产等严重后果[13]。2018年中国饲料原料及饲料霉菌毒素检测报告显示真菌毒素污染普遍存在，小麦及麸皮是DON污染最为严重的原料[14]。为了保护畜牧养殖业的健康发展和人类的健康消费，中国规定饲料原料或饲料中DON的含量最高为5 000 μg/kg，用于食品的谷物及谷物产品中DON的最大限量为1 000 μg/kg[15]。因此，如何有效控制和去除谷物、粮油副产品及饲料中的呕吐毒素，对改善动物生产性能和提高人类的食品安全具有非常重要的意义。

目前去除DON方法有物理法、化学法和生物降解法[16]。研究表明，传统的物理和化学法[17]脱除DON的技术存在不易操作、难以规模化应用，以及脱毒制品的营养成分损失大和制品适口性差等弊端。生物降解法因具有效率高、特异性强、环境无污染、不影响营养价值等优点，备受研究者的关注[18]。生物降解法是利用微生物或其产生的降解酶将呕吐毒素分解或代谢为低毒或无毒产物[19]。2013年，以菌株BBSH797开发的产品百霉克被广泛应用于畜禽养殖，实现了DON脱毒菌剂商业化，呈现出巨大的应用潜力[20]。如何筛选获得高效降解菌，并解析其降解途径是推进优良降解DON微生物菌株的前提和基础[21,22]。本研究在前期研究基础上，筛选获得一株可高效降解DON的菌株，在完成菌株鉴定后，采用液质联用(LC-HRMS)初步推测其降解机理，评估该菌株在粮食及其副产物中DON的脱毒效果，为在实际生产中应用于脱除粮食和饲料中DON的相关技术开发提供支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品：采集自吉林长春、河南郑州和西藏拉萨等地区的土壤、河流污泥和动物粪便等共133份样品，密封冷藏于实验室备用。

培养基：无机盐培养基(MSM)(g/L)：(NH4)2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl20.05 g，Na2HPO42.44 g，KH2PO41.52 g，加去离子水定容至1 000 mL，pH为6.8。在培养基中添加浓度为10 μg/mL的DON做为菌株定向筛选培养基。LB培养基(g/L)：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，加去离子水定容至1 000 mL。固体培养基添加1.5%的琼脂。

1.2 主要试剂及仪器

DON标准品为本实验室制备提取[23]；甲醇、乙腈均为色谱纯级；呕吐毒素免疫亲和柱；酵母提取物等其他试剂均为分析级。

E2695高效液相色谱仪，waters xbridge C18色谱柱，C1000PCR仪, Gel Doc XR+凝胶成像仪。

1.3 实验方法

1.3.1 DON降解菌筛选和分离

富集和初筛：取10 g样品于100 mL MSM培养基中，DON浓度为10 mg/L，在30 ℃，220 r/min恒温振荡培养7 d，以10%接种量转接3次，高效液相色谱(HPLC)检测DON残留量，选择具有DON降解效果的样品进行下一步实验。

复筛：将初筛具有降解效果的样品经过适当梯度稀释后涂布于MSM平板上，挑取形态各异的单菌落接至含有10 mg/L DON的1 mL MSM培养液中，在30 ℃，220 r/min条件下培养7 d。检测DON残留量，挑选具有降解能力的单菌株。

1.3.2 降解菌活性物质的定位

挑取具有高效降解能力的单菌落接种于50 mL MSM培养液中，在30 ℃，220 r/min条件下培养72 h。发酵液在5 000 r/min离心5 min获得发酵上清液(胞外液)；发酵液离心后弃上清，菌体经等体积MSM培养液重悬后超声破碎，5 000 r/min离心5 min，获得发酵液破碎上清液(胞内液)。分别取胞外液和胞内液500 μL，加入含有10 mg/L DON的1 mL MSM培养基中，在30 ℃，220 r/min条件下培养12 h，以各自高温灭活的上清液为对照，测定DON残留量。

1.3.3 菌种鉴定

形态鉴定：将获得的菌株在MSM培养基上划线，30 ℃培养24～72 h，观察菌落形态、大小、边缘、表面隆起形状、透明度等。对菌株进行革兰氏染色，于显微镜下观察细胞形态特征。

分子鉴定：对降解菌株进行16S rDNA或18S rDNA鉴定。按照细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明提取基因组DNA作为模版进行PCR扩增。16S rDNA通用引物16SF：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，16SR：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，18S rDNA通用引物18SF：5’-GTAGTCATATGCTT-3’，18SR：5’-ATTCCCCGTTACCCGTTG-3’进行PCR扩增。反应体系：模版1μL，Premix Taq 12.5 μL，16S/18S上下游引物引物各1 μL，双蒸水10.5 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，30个循环，72 ℃延伸10 min。将PCR产物进行测序，将测序结果在NCBI中进行比对。

1.3.4 DON降解率测定

DON含量测定参考高效液相色谱法(GB 5009.111—2016)[24]。色谱柱：C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：水/甲醇=80/20；流速1.0 mL/min；柱温25 ℃；进样量10 μL；紫外检测器：激发波长(Ex)=218 nm。

DON降解率=降解后培养基中DON含量/原培养基中DON的含量×100%。

式中：原培养基中DON的含量为10 mg/L。

1.3.5 DON降解菌降解机理初步分析

降解曲线：DON降解菌接入含有10 mg/L DON的1 mL MSM培养液中，在30 ℃，220 r/min条件下培养5 d，每间隔24 h取样，测定DON残留量，绘制降解曲线。

质谱分析：DON含量测定参考高效液相色谱法。选取上述0～3 d样品进行质谱分析。质谱分析方法：正离子模式，色谱柱：poreshell 120 EC-C18,(2.1 mm×100 mm)；柱温度：40 ℃；流动相：A：水/甲酸铵=99.9/0.1，B：甲醇/甲酸=99.9/0.1；梯度洗脱程序：0～1 min，10% B；1～1.5 min，45% B；1.5～8.5 min，B相由45%升至100%，保持1 min后回到初始流动相保持0.5 min，准备下一次进样；流速：0.3 mL/min；进样量：2 μL。

1.3.6 降解效果应用评价

生长曲线：挑取降解菌单菌落于LB培养基中，在30 ℃，220 r/min条件下培养60 h，每间隔4 h取样测定OD值，以时间为横坐标，OD600为纵坐标，绘制生长曲线。

脱毒应用：依据生长曲线实验参数，挑取降解菌单菌落接种至LB培养基中，在30 ℃、220 r/min条件下培养至对数期作为种子液。以10%的接种量接入DON含量超标的小麦、DDGS和玉米稀浆培养基中，在30 ℃、220 r/min条件下培养18 h，取样检测物料中DON残留量，分析降解效果，物料中DON提取方法参见国标法。

2 结果与分析

2.1 降解菌的分离和纯化

根据1.3.1的方法对133份采集样品进行特异性富集，以DON为唯一碳源，具有DON降解能力的富集液多达32份。在LB平板上对32组富集液进行涂布培养，挑取平板上长出的形态各异的单个菌落划线纯化，获得单菌株14株，分别编号为D-1～D-14。单菌株分别接种到含10 mg/L DON的1 mL MSM培养液中，培养7 d，D-1、D-4、D-8和D-14具有明显降解效果，降解率分别为67.07%、37.23%、98.40%和32.50%。不同来源的单菌株对DON降解效率差异较大，来源于河南省郑州市高新区河流污泥样品的菌株D-8培养第3 d降解率即可达98.4%，几乎将10 μg DON消除，D-8较其他菌株降解能力更高效。选择此菌株进行下一步研究。

2.2 降解菌的活性物质定位

菌株D-8发酵上清液和菌体破碎上清液各500 μL，加入含有10 mg/L DON的1 mL MSM培养基中，发酵上清液即为胞外液，菌体破碎后上清液即为胞内液，胞内液和胞外液对DON的降解率分别为83.48%和17.23%。同时，将获得的上清液灭活处理几乎没有降解效果。Carere等[25]已从德沃斯氏菌株找到活性物质，本研究结果表明，菌株D-8对DON的降解不是菌体的吸附作用，而是菌体产生的某种可降解DON的活性物质，可能是一种菌体表达的酶蛋白[26]。

2.3 降解菌株鉴定

2.3.1 形态鉴定

菌株D-8在LB培养基上能较好生长，大部分菌落符合细菌特征，30 ℃，经3 d培养其菌落形态呈象牙白色、圆形且边缘整齐，表面光滑且凸起，大小0.5～1.5 μm(图1a)；显微镜下的形态为细小棒状，无孢子形成，为革兰氏阴性菌(图1b)。

图1 D-8的菌落图(a)和显微镜检图(b)

2.3.2 分子鉴定

采用细菌16S rDNA通用引物扩增菌种的保守序列，将扩增产物进行测序，测序结果在NCBI Blast N中进行同源性比对。利用MEGE5.0软件构建系统进化树(图2)，菌株D-8和DevosialimiLMG 22951同源性高达97%。根据菌株16S rDNA的相似性、系统发育树和菌落形态，初步鉴定D-8为德沃斯氏菌株。目前，已有学者开展DON降解菌剂应用于畜禽养殖研究。计成等[27]分离一株高效DON降解菌枯草芽孢杆菌ANSB471，对饲料中呕吐毒素的降解率可达到97.34%。德沃斯氏菌株降解DON具有潜能，本研究筛选德沃斯氏菌可高效降解DON，在应用上可开展进一步深入研究。

图2 菌株系统发育树

2.4 菌株D-8降解机理初步分析

菌株D-8降解曲线表明，在MSM培养基中，该菌生长虽然缓慢，但对DON有较好的降解效果。从发酵第1 d开始降解速率明显加快，培养3 d即可将培养液中DON毒素完全清除。菌株D-8与He等[28]筛选的德沃斯氏菌相似，均可高效降解DON，降解率90%以上，具有较好的应用前景。

菌株D-8降解产物质谱分析表明，降解过程提取EIC图谱(图3a)，随着发酵时间的增加，DON峰值降低，产物峰值逐渐增加。发酵1 d，DON含量即减少，在质荷比297.133 3分子质量下出现2个物质峰，相同分子质量的产物峰逐渐增多，发酵3 d，DON几乎转化为产物。对转化产物进行质荷比分析(图3b)，质荷比为[M+H]+=297.134 3，表明菌株D-8产生的活性物质将DON转化为分子质量相同的产物，此产物较稳定，不容易恢复成DON。目前，Hassan等[29]报道德沃斯氏菌株可将DON转化为3-eip-DON。结合已有研究，菌株D-8转化产物与Hassan等[29]报道一致，解析此代谢过程可能发生两步反应，底物DON分子在降解菌的作用下，生成中间体3-酮基-DON(3-keto-DON)，再经差向异构生成终产物3-eip-DON，3-eip-DON毒性低于DON，可作为DON脱毒有效降解途径。

注：a：菌株D-8降解过程DON产物峰EIC图谱(1：DON，2：3-epi-DON)；b：D-8降解DON产物质荷比分析。图3 菌株D-8降解产物质谱分析

2.5 降解菌降解效果评价

以时间为横坐标，OD600为纵坐标，绘制菌株D-8生长曲线(图4)，D-8接种于LB培养基中，在30 ℃，220 r/min条件下培养，于18 h进入对数生长期，36 h进入稳定期。

图4 菌株D-8生长曲线

谷物及其副产品在深加工过程中存在呕吐毒素浓缩效应，从而导致部分副产物及喷浆饲料产品中呕吐毒素含量明显超标，本研究初步探索德沃斯氏菌D-8在玉米稀浆、DDGS等谷物及其副产物中DON脱毒初步应用。将D-8菌株以10%的接种量接种至各DON超标物料培养基中，培养18h，处理组经免疫亲和柱净化后，检测DON的残留量(图5)，小麦处理组脱毒效果相对最佳，可将小麦中DON质量分数由6 110.42 μg/kg降为115.41 μg/kg，降解率为98.11%；玉米稀浆次之，可由2 679.52 μg/kg降为995.60 μg/kg，降解率为62.84%；DDGS效果略差，仅由1 502.75 μg/kg降为864.31 μg/kg，降解率为42.5%。菌株D-8在3种原料中的降解能力为小麦>玉米稀浆>DDGS。分析其原因，3种物料脱毒差异性可能是各物料中pH值、营养物质含量及比例不同，小麦粉初始pH值偏中性，而DDGS和玉米稀浆偏酸性，小麦粉pH值适中，营养成分均衡，有助于菌株生长[30]，脱毒效果较好；其次，玉米稀浆脱毒效果可能受无机盐种类和含量的影响，脱毒效果次之；最后，DDGS物料中可能存在与菌株降解酶的辅酶具有竞争或者抑制作用的物质[31]，从而导致其脱毒效果略差。目前，玉米稀浆、DDGS等深加工副产物脱毒应用技术难度大，鲜有报道。本研究利用生物降解法，初步实现同一菌株在不同物料中的脱毒应用研究，经菌株发酵处理后不同物料中DON含量均可低于国家限定标准。同时，这也表明德沃斯氏菌D-8具有可研制成真菌毒素生物脱毒菌剂的潜力，可为为副产物高值化利用提供菌株资源。

图5 菌株降解3种原料中DON的情况

3 结论

本研究分离获得一株高效降解DON的微生物菌株。经形态学和分子生物学手段相结合，初步鉴定为德沃斯氏菌(命名D-8)。D-8菌株在MSM培养基中3 d内可将10 μg DON几乎完全降解，降解率达98.4%。

采用质谱分析表明，D-8菌株可通过两步反应将DON转化为质荷比为297.134 3的产物，经过分析推导为3-epi-DON，根据已有报道，3-eip-DON为DON的同分异构体，且毒性低于DON，可作为DON脱毒有效降解途径[32]。本研究利用生物降解法，初步实现同一菌株在不同物料中的脱毒应用研究，以谷物及其副产物为原料，以D-8为发酵菌株，经过18 h发酵，小麦、玉米稀浆、酒糟蛋白(DDGS)中的DON降解率分别为98.11%、62.84%和42.5%。发酵小麦中的DON初始质量分数由6 110.42 μg/kg降解至115.41 μg/kg，脱毒效果相对最佳。经菌株D-8发酵处理后不同物料中DON含量均低于国家限定标准。该研究的结果可为DON污染粮食及其制品的脱毒应用提供可行的处理途径。后续实验将深入全面开展降解菌D-8稳定性、耐酸耐高温定向诱变育种、饲用安全性和有效性等多方面研究，力求将其开发成一种高效、安全的能够应用于饲料和食品中的DON生物脱毒菌制剂。