蟾蜍灵对人胃黏膜上皮细胞GES-1的毒性研究

刘玉玲，刘利，邓佳丽，郭祉良

(1.山西医科大学汾阳学院，山西汾阳 032200；2.山西省汾阳医院，山西汾阳 032200）

蟾蜍灵是传统中药蟾酥的主要活性成分之一，具有抗癌、镇痛等多种作用[1]。目前研究发现蟾蜍灵可作用于肿瘤，但其研究过程中对正常细胞毒副作用的报道却较少[2-5]。本研究通过蟾蜍灵处理体外培养的人胃黏膜上皮细胞GES-1，了解蟾蜍灵对GES-1细胞的毒性作用，为其应用于临床提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蟾蜍灵（含量≥98%，MB7115），大连美伦生物科技有限公司，使用时用无水乙醇配成1 mmol/L的母液，根据使用需要将母液稀释为相应浓度；青霉素-链霉素双抗溶液（penicillin-streptomycin）（批号：B540732）、乙醇（批号：A500737）、DMEM培养基（批号：E600003），胰蛋白酶（批号：A003702），噻唑蓝（Methyl Thiazolyl Tetrazolium，MTT）（批号：A100793）、二甲亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）（批号：A100231），生工生物（上海）股份有限公司；小牛血清（批号：11011-8611），杭州四季青生物工程材料有限公司。

人胃黏膜上皮细胞株GES-1为山西医科大学汾阳学院检验系张笑添老师赠予。

1.2 仪器与设备

Galaxy 170S二氧化碳培养箱，德国Eppendorf公司；MX2型微孔板振荡器，韩国FINEPCR公司；Infinite F50型酶标仪，瑞士Tecan公司；TG-16型离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Ti-S倒置荧光显微镜，日本尼康公司；DM500光学显微镜，德国Leica公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

GES-1细胞培养于含有10%小牛血清、1%青链霉素的DMEM培养基中，置于37 ℃、浓度为5%的CO2培养箱中。培养2～3 d，使细胞处于对数生长期，用0.25%胰酶消化，计数并放于培养箱中传代培养。

1.3.2 MTT法检测GES-1细胞抑制率

取对数生长期的GES-1细胞，加入培养基，充分混匀制成细胞悬液，接种于96孔板中，每孔2 000个细胞，100 μL/孔，放置过夜。细胞贴壁后，分别加入蟾蜍灵（0 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L），每组设立3个复孔，于37 ℃培养箱分别培养24 h、48 h、72 h后，向每孔中加入20 μL MTT溶液（工作浓度为5 mg/mL）混匀继续培养4 h后，小心吸弃孔中培养基，向每孔中加入150 μL DMSO，放置10 min。用酶联免疫标记仪在450 nm处测定吸光值（OD），实验重复3次，计算细胞生存率。

1.3.3 细胞形态学观察

细胞接种于96孔培养板中，培养过夜，细胞贴壁后加入不同浓度的蟾蜍灵（0 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L），培养48 h后，放置在光学显微镜下进行观察拍照。

1.3.4 细胞内ROS含量的检测

采用荧光探针DCFH-DA检测GES-1细胞内活性氧（ROS）含量，终浓度为10 μmol/L。DCFH-DA被ROS氧化为二氯荧光黄（DCF），产生绿色，通过细胞内DCF的荧光强度，即可相对定量细胞内ROS的水平。实验时，细胞接种于96孔培养板中，培养过夜，细胞贴壁后加入不同浓度的蟾蜍灵（0 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L），培养48 h后，用无血清培养基清洗细胞3次，向细胞中加入100 μL稀释好的DCFH-DA工作液，于37 ℃细胞培养箱内孵育20 min，然后用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，放置荧光显微镜下观察DCFH-DA的荧光。

1.4 统计学方法

采用GraphPad Prim6统计软件进行数据分析，所有数据均以（±s）表示；采用t检验对不同实验组之间的数据进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同浓度蟾蜍灵对人胃黏膜上皮细胞GES-1生存率的影响

以 0 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L浓度的蟾蜍灵作用GES-1细胞24 h、48 h和72 h后，通过MTT检测细胞的生长水平。如图1所示，在蟾蜍灵处理细胞24 h时，与对照组（0 nmol/L）相比，1～100 nmol/L的蟾蜍灵对GES-1细胞无杀伤作用（P＞0.05）；而蟾蜍灵作用细胞48 h和72 h时，随着药物浓度的增加，与对照组（0 nmol/L）相比，GES-1细胞的生长受到了明显抑制，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。结合实验结果和参考文献[6]，用0 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L的蟾蜍灵处理细胞48 h进行后续实验。

图1 不同条件下蟾蜍灵对GES-1细胞生存率的影响

2.2 不同浓度蟾蜍灵对GES-1细胞形态的影响

如图2所示，蟾蜍灵浓度为0 nmol/L时，细胞的形态呈梭形，且细胞密度较高；随着蟾蜍灵浓度的增加，GES-1细胞的形态由梭形向圆形转变，体积减小，细胞的密度也相应降低。

图2 不同浓度蟾蜍灵对GES-1细胞形态的影响

2.3 不同浓度蟾蜍灵对GES-1细胞中ROS含量的影响

细胞中绿色荧光的强度可反应细胞内ROS含量的变化。如图3所示，随着蟾蜍灵处理浓度的增加，GES-1细胞中绿色荧光的强度增加，表明高浓度的蟾蜍灵可以诱导细胞产生大量的ROS，使其含量增加。

图3 不同浓度蟾蜍灵对GES-1细胞中ROS含量的影响

3 讨论

许多研究报道，蟾蜍灵通过不同的途径抑制肝癌、肺癌、肠癌以及胃癌等多种肿瘤细胞生长，诱导细胞的凋亡[2-8]。张滢等[9]研究发现不同浓度蟾蜍灵在处理正常肝细胞LO224 h时，蟾蜍灵对正常肝细胞无杀伤作用，在48 h和72 h时，随着药物浓度的增加和作用时间的延长，蟾蜍灵对正常肝细胞有一定的抑制作用。也有研究报道浓度小于20 nmol/L的蟾蜍灵作用正常宫颈细胞48 h时，对正常宫颈细胞的生长没有抑制作用[5]。

本研究利用不浓度蟾蜍灵分别作用于人胃黏膜上皮细胞GES-1 24 h、48 h和72 h，结果发现，在处理24 h时，不同浓度的蟾蜍灵对GES-1细胞无杀伤作用。但是随着作用时间的延长，蟾蜍灵表现出抑制GES-1细胞的生长并影响细胞形态，诱导细胞产生大量的ROS，而大量ROS是引起细胞内氧化损伤的重要因素，如造成DNA的损伤、蛋白酶活性的氧化等[10-11]。

目前针对肿瘤的治疗方法多为手术切除和术后化疗等，但该种方法治疗效果差，且易于复发。因此，人们开始寻找有效的药物进行治疗，同时要最大限度地降低药物对自身正常细胞的毒性。本实验初步研究发现，低浓度的蟾蜍灵在一定的作用时间内，对正常胃黏膜上皮细胞无杀伤作用。这为蟾蜍灵以后作为肿瘤治疗药物提供了参考依据。