循环肿瘤细胞簇与肿瘤转移的研究进展

夏成茂，姬菩忠，杨瑞婷，郭益辰，刘 斌，杨艳丽

肿瘤转移是癌症相关死亡的主要原因，据统计每年发生转移的实体瘤患者病死率>90%[1]。其转移途径主要包括：原发灶肿瘤细胞的血液内渗、循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTC)在血液中的存活以及远处外渗、CTC在转移部位的沉积[2]。CTC作为一种异质性肿瘤细胞群，在血管中主要以游离或成簇的形式存在。研究发现，与游离CTC相比，CTC簇具有特殊的表型、基因表达模式和更强的转移能力，其转移能力为游离CTC的23～50倍[3]。由于分离检测技术水平的限制，对CTC的研究尤其是CTC簇的研究尚不清楚。该文就CTC簇的物理特性、起源、转移机制及临床价值进行综述，为肿瘤转移的临床治疗提供理论参考。

1 CTC簇的物理特性及起源

CTC簇被称为循环肿瘤微栓子、循环微转移或循环肿瘤聚集物，最早发现于肿瘤患者的外周血中[4]，主要由2个或2个以上的肿瘤细胞聚集而成，主要包括两种类型：单纯由癌细胞聚合形成的同质CTC簇和与基质或免疫细胞等相互作用而形成的异质CTC簇[5]。

1.1 CTC簇的物理特性CTC簇通常认为由一定数量的肿瘤细胞聚合而成，其中可带有部分非肿瘤细胞成分，如间充质细胞、上皮细胞、周细胞、免疫细胞、血小板和癌症相关成纤维细胞等[6-7]。因此，相比游离CTC，其更有可能滞留在肺和远端器官的小毛细血管中，从而导致血管壁破裂形成远处转移[8-9]。也有研究发现，CTC簇与游离CTC相比，血液移动速度明显降低，通过与E-selectin相互作用，更易发生边缘化、旋转和附着在血管壁内皮细胞上[10]。目前，除了已知的球团状CTC簇外，还观察到其它与迁移相关的CTC簇外观表型，其中最主要的是线性和三角形CTC簇[11]，这些特殊簇状结构为CTC细胞提供更利于存活的肿瘤微环境——低氧微环境[12]。在CTC簇如何进行血行转移的研究基础上，Au等[13]利用微流控装置和斑马鱼模型发现≤20个细胞的CTC簇具有高度可塑性，如在穿越毛细血管前，CTC簇内的细胞可迅速重组成单链状，大大降低流体动力阻力，穿越后这些细胞又能重新恢复簇状形态，证明CTC簇可在生理条件下造成远处器官转移，且其侵袭能力远高于游离CTC。

1.2 CTC簇的起源肿瘤原发灶和转移灶的异质性是影响患者预后和治疗反应的重要因素，主要原因是CTC的起源、转化细胞的分化状态、癌细胞的可塑性以及微环境相互作用[14]。CTC簇是源于主动从肿瘤部分分离并集体迁移入血管的黏聚细胞群，还是来自于原发肿瘤被动脱落进入受损血管系统，少见文献报道。Aceto等[2]在研究小鼠乳腺癌模型时发现，通过在小鼠左、右两侧乳房脂肪垫里分别注射不同荧光标记的肿瘤细胞，5周后小鼠肺部出现独立且有差异标记的肿瘤，抽取外周血并采集肺部转移灶，发现外周血中只有4%的CTC簇为多色，其余均为单色。推断这种多色的CTC簇可能来源于游离CTC罕见的血管内聚集；同时在肺转移灶中观察到92%的单色肿瘤和8%的多色肿瘤，进一步验证绝大多数CTC簇起源于原发灶，而非游离CTC的血管内聚集。同时Maddipati等[15]也在类似的模型中支持上述研究结果。针对罕见游离CTC的血管内聚集形成CTC簇，Hong等[16]通过设计体外血流模拟平台，证实在物理作用下游离CTC的血管内聚集/增殖发生率较低，而位于炎症部位或被小血管拦截时，可少量聚集和增殖。

有研究证明，CTC簇进入血管的方式包括两种：(1)通过渗漏的血管进入血液循环[17]；(2)在循环血细胞(如肿瘤浸润巨噬细胞、中性粒细胞等)的引导下进入血液循环[18-21]。目前关于这方面的分子机制研究仍较少，可作为未来研究的新方向。

2 CTC簇促进血行转移的分子机制

CTC簇离开原发肿瘤和肿瘤微环境，在血液循环中将面临氧化应激、血流剪切力、免疫攻击等挑战[22]。其在血液循环中存活并发生血行转移分子机制的探索将有利于指导临床的肿瘤个性化治疗。

2.1 CTC簇表达细胞间黏附蛋白细胞间黏附蛋白高表达是CTC在血液中以簇状形式存在的决定因素，包括参与紧密连接和桥粒的蛋白，这些蛋白的高表达增加了其转移潜能[23]。有研究表明，CTC簇中JUP基因编码的桥粒组成蛋白的表达量为游离CTC的219倍。此外，盘状球蛋白(plakoglobin)在细胞间黏附结构中起到和α-连环蛋白连接的作用，维持CTC簇的稳定和细胞极性，在转移性乳腺癌小鼠模型中，利用shRNA下调plakoglobin导致CTC簇急剧减少；此外，Chen等[24]研究结果亦表明，敲除DSG3后会破坏其与plakoglobin的结合，可抑制CTC簇的迁移和侵袭。总之，促进CTC簇形成及转移的细胞间黏附蛋白仍有许多，包括受PDGF和TGF-β1调节的Fibronectin等都可能成为治疗肿瘤转移的靶标。

2.2 CTC簇的干细胞特性及上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)癌症干细胞(cancer stem-like cells, CSC)又称为肿瘤起始细胞，具有自我更新、分化和转移扩散的能力。CD44作为干细胞标志物，参与多种肿瘤干细胞信号的维持[25]。部分研究认为CTC簇内的CSC具有干细胞特性，可引起CTC簇过表达CD44，且在乳腺癌源性异种移植模型和患者分离的CTC簇中均发现干细胞相关基因表达上调，这些基因编码干细胞特异性转录因子OCT4、NANOG和SOX2[26]。EMT是肿瘤转移的主要机制之一[27]。研究表明，游离CTC与CTC簇的EMT均会导致其转移和迁徙能力增强，CTC簇内的EMT状态比游离CTC更加明显，如在非小细胞肺癌患者的CTC簇中发现EpCAM和CK的异质表达[28]。从大多数转移性非小细胞肺癌患者血液中分离出来的CTC簇具有上皮和间充质双表型，表明CTC簇的EMT发生是一动态过程[29]。同时，在胰腺癌小鼠模型中发现EMT发生相关因子ZEB1和SNAIL的表达是肿瘤细胞侵袭和转移的必须条件，SLUG表达可以使得原本非转移细胞获得转移能力，证实EMT过程对肿瘤转移的重要性[30]。然而，部分研究表明在游离CTC和CTC簇之间未发现EMT的差异表达，认为EMT对于获得高迁移能力的游离CTC是必需的，但对于CTC簇而言并不重要[22]。因此，EMT在CTC簇形成和转移中的作用仍有待后续进一步分析。

近年，文献报道CTC簇中约60%的CSC表达上皮和间充质基因，表明具有上皮/间充质杂交表型的CSC在CTC簇的侵袭和迁移过程中发挥关键作用[31]。目前，关于CTC簇内CSC与EMT表型之间的关系及其内在机制研究仍较匮乏。

2.3 CTC簇的异质性CTC簇内除了含有肿瘤细胞外，还有许多非肿瘤成分也可促进CTC簇的生存和转移[30,32-34]，如间质细胞(成纤维细胞、内皮细胞或肿瘤浸润髓系细胞)的存在增加CTC簇内肿瘤细胞的活力，并促进转移的形成[35]。当CTC和内皮细胞共培养后，在内皮细胞存在的情况下，肿瘤细胞更能有效地促进血管生成，导致转移瘤数量增加和体积增大[36]。CTC簇中的血小板除了通过旁分泌信号和直接接触保护肿瘤细胞免受血液剪切力的损伤和免疫攻击外[37]，还通过TGF-β/Smad和NF-κB途径诱导肿瘤细胞发生EMT，促进肿瘤转移[38]。CTC还能与免疫细胞结合，形成免疫细胞-CTC簇逃避免疫监视，促进自身的生存和迁移。如，有文献报道中性粒细胞表面的Mac-1或β2-整合素可与CTC上表达的细胞间黏附分子结合，帮助CTC簇跨越内皮屏障，引发种植；与此同时，中性粒细胞还可以通过产生“中性粒细胞胞外陷阱”来捕获CTC，增加CTC的迁移和增殖[39]。有研究表明，肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage, TAM)和肿瘤细胞的相互作用不仅对原发肿瘤部位的进展很重要，而且对CTC的增殖和分化也很重要，CTC可以与巨噬细胞融合，形成混合细胞(即异质CTC簇)，共享肿瘤细胞和巨噬细胞的标记，从而不受免疫系统监测，具有更强的入侵潜力[18]。除上述研究外，在CTC簇中还发现CK+树突状细胞，但关于此细胞对于CTC簇存在的意义目前尚不清楚。总之，CTC簇复杂的组成结构具有明显的异质性，未来可将研究重点放在这些细胞的相互作用上，将有助于开发新的生物学标志物，以及新的潜在治疗靶点。

2.4 CTC簇介导的免疫逃逸CTC簇介导的免疫逃逸是其易形成转移的主要原因之一，如下调MHCⅠ和(或)MHCⅠ相关蛋白表达，从而阻止NK细胞的细胞毒性和细胞溶解能力。其表面表达的PD-L1，可抑制T细胞的免疫应答效能，除PD-1/PD-L1外，还包括CTLA-4和相关B7家族成员的表达。有研究通过比较结直肠癌患者原发肿瘤和CTC的基因表达谱发现，CD47是CTC中唯一上调的基因，表明外周血CTC表达CD47具有生存优势，CTC簇通过上调CD47表达，可使其逃避巨噬细胞和树突状细胞的吞噬作用。同时CTC簇表面FASL的表达，可激活T细胞表面的FAS受体，诱导T细胞凋亡[39]。此外，CTC簇还能有效的适应外在环境，从而逃避免疫追杀，如CTC簇能在缺氧环境中存活，而免疫细胞在缺氧的环境下却无法正常执行其功能，通过缺氧-诱导免疫逃逸。离开原发部位肿瘤微环境的肿瘤细胞团更容易受到免疫介导的消灭作用，但有部分CTC簇能在血液循环中幸存并形成远处转移，探究这些少部分CTC簇的免疫逃逸机制，不仅有助于临床治疗，而且还可能提供耐药性发展的重要信息，对癌症免疫治疗时代具有转化意义。

3 CTC簇的临床价值

CTC簇作为肿瘤转移因素之一，在诊断、评估治疗、复发和转移进展方面具有潜在的研究价值。Aceto等[2]在多个时间点抽取79例转移性乳腺癌患者(单雌激素受体阳性，单HER-2阳性，或三阴型乳腺癌)的血液样本，分离出患者血液中的CTC簇，结果显示在晚期转移性乳腺癌患者中，CTC簇的持续存在与不良预后相关。为进一步证明CTC簇与较长病程患者不良预后之间的相关性，作者同样用类似的方法测量了64例前列腺癌患者CTC簇与无进展生存期的关系，结果同样显示CTC簇与癌症进展存在潜在相关性。

近期，Koh等[40]通过对乳腺癌游离CTC和CTC簇的全基因组DNA甲基化和RNA表达进行分析，以了解CTC簇的生物学特征，结果显示CTC簇高表达增殖及干细胞相关基因，其低甲基化区域与乳腺癌的不良预后相关。并对2 486种FDA批准的药物进行评估后发现Na+/K+-ATP酶抑制剂(如洋地黄毒苷)和微管蛋白结合剂(rigosertib、podofilox、秋水仙碱、硫酸长春新碱)能使CTC簇分离成游离CTC，并显著降低平均CTC簇的直径。此外，CTC簇还能在胰腺癌、肺癌和卵巢癌等[41-42]癌症患者的血液循环中发现，且该类型细胞的存在与患者的不良预后和无进展生存期相关。

4 总结与展望

在肿瘤细胞的血行转移过程中，CTC簇特殊的物理特性导致其远处转移的能力较游离CTC显著提高，具有更强的生存能力和转移潜能；CTC簇比游离CTC具有更高细胞间黏附蛋白及干细胞特性，同时更易发生EMT，以及参与免疫逃逸。

因此，对CTC簇促进肿瘤转移的分子机制研究将有助于我们更新对肿瘤转移的理解。但仍有问题亟待解决：(1)CTC簇的分离及检测，目前的分离系统主要是针对游离CTC的分离筛选，而如何将特异性的CTC簇进行分离，并保持其原始状态仍是有待解决的难题。(2)对于CTC簇的产生、循环及远处种植的生物学行为细节仍需进一步探索。(3)CTC簇分为同质性和异质性，两者之间是否具有不同的形成机制和转移优势。(4)CTC簇的临床治疗意义有待进一步证实，针对CTC簇的治疗可能使部分隐藏于团簇状结构中心的肿瘤细胞无法与抗癌药物接触，从而影响药物的治疗反应；同时CTC簇内可能还包含了多种具有不同耐药性的肿瘤细胞，使得普通化疗药物无法产生预期效果。后续随着这些问题的解决将会为CTC簇的研究开辟新领域，并能进一步肯定其在临床实践中的价值。