抗菌肽抗病毒作用机制和应用研究进展

刘双双，秦保亮，朱春玲，赵娅娅，赵雪芹，夏小静，胡建和，王丹辉，王 磊*，安志兴*

(1.河南科技学院动物科技学院，河南新乡 453003；2.新乡市动物疫病预防控制中心，河南新乡 453003；3.吉林省松原市前郭县动物疫病预防控制中心，吉林松原 138000)

抗菌肽(antimicrobial peptide)是一种短且带正电荷的寡肽，主要合成并储存在髓系来源的细胞和上皮细胞中，当机体受到感染时，这些细胞率先发挥作用，抗菌肽介导的免疫反应在机体被感染后迅速激活，是先天免疫系统的基本组成部分，在对抗损伤和感染的第一道免疫反应中起着至关重要的作用，同时也是组成黏膜防御的重要物质[1]。抗菌肽分布广泛，可以从昆虫、哺乳动物、两栖类动物、植物、病毒以及人类中分离得到,主要表达在动物免疫细胞、脏器黏膜、皮肤中[2]。大多数抗菌肽通过多蛋白前体形式在体内合成，在蛋白水解的过程中，释放出具有活性的肽段，这些具有活性的肽段可以单独存在，也可以以多个拷贝的形式存在，在哺乳动物中，已经经过修饰和加工的功能性肽被划分为许多类，被研究较多的功能性抗菌肽包括防御素、抗菌素、皮抗菌素、人类抗菌蛋白、组蛋白、转铁蛋白、从已知蛋白衍生的抗菌肽、从免疫细胞衍生的抗菌肽、趋化因子、抗菌神经肽和β-淀粉样蛋白肽等[3-4]。目前，所有的抗菌肽均已被证明具有抗菌活性，但只有少数抗菌肽具有抗病毒活性，抗菌肽对免疫调节具有多种作用，其作为抗生素的代替品，在细菌感染中被深入研究，近年来病毒疗法得到广泛关注[5]。鉴于此，针对抗菌肽在治疗病毒感染的机制和应用的研究进展归纳总结，以期为更好地开发抗菌肽成为抗病毒病原体药物提供理论参考。

1 防御素

防御素(defensin)具有含量高、分布广泛的特点，可以调节免疫反应，且在先天免疫中发挥核心作用。防御素最初从猕猴白细胞中分离出来，几乎分布在所有的生物类群中，根据其二硫键位置可分为α、β和θ3个亚群，到目前为止，在不同的免疫系统中，已经发现6种α-防御素肽和31种β-防御素肽[6]。在6中不同的α-防御素中，4种(HNP-1,2,3,4)由髓系细胞产生，如巨噬细胞、自然杀伤细胞、一些T细胞和B细胞，另外2种(HD5，HD6)在小肠上皮细胞中表达，β-防御素通常在鸟类和哺乳动物中表达，主要由上皮细胞和角质形成细胞表达[7]。

1.1 防御素的抗病毒作用

防御素的抗病毒活性最早被报道于1986年，从那时起，防御素已表现出在抗病毒免疫中的作用，包括抗病毒作用和免疫调节。近年来发现防御素对疱疹病毒、水泡性口炎病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)、乳头瘤病毒等有保护作用，最近的一些研究阐明了防御素在抗病毒活性中的多种机制，防御素可以直接作用于病毒颗粒、或者通过间接干预病毒生命周期的各个阶段去阻断病毒的感染[8]。现有数据表明，防御素的抗病毒活性主要发生在病毒进入阶段，但是也有在其他阶段显示出抗病毒作用的报道，例如通过影响病毒在已受感染细胞内的传播发挥抗病毒作用[9]。防御素还可以通过改变病毒感染引起的先天免疫反应来发挥其抗病毒活性，其中包括调节并募集 T 细胞、巨噬细胞和树突状细胞到感染部位，促进伤口的愈合、血管的生成以及树突细胞的分化与成熟，此外，还可以诱导巨噬细胞、肥大细胞和角质形成细胞产生促炎细胞因子，以及参与细胞死亡途径的调节[9]。

1.2 防御素抗病毒应用与机制

干扰病毒的吸附和进入可以有效阻断病毒感染细胞，越来越多的证据表面防御素能在病毒入侵的不同阶段阻断病毒的进入。例如，α-防御素肽已经被证明在体外有抑制甲型肝炎感染的能力，人腺病毒(HAdV)是一种无包膜的双链DNA病毒，能够感染人类的呼吸、胃肠道、眼部、和排泄系统，已发现有100余种血清学，目前用于治疗甲型肝炎感染的治疗策略有限，研究中发现，α-防御素在体外具有抑制甲型肝炎感染的能力，当细胞在被甲型肝炎病毒感染前使用防御素肽预处理时，HD5减少了95%病毒的复制，该研究小组进一步发现当细胞在感染甲型肝炎病毒后30 min～60 min后加入防御素肽，HD5减少了50%病毒的复制，表明了HD5对甲型肝炎病毒的抑制作用发生在早期阶段[10]。其他研究表明，HD5在细胞感染前直接和HAdV颗粒结合，阻止病毒颗粒从核内体释放，随后，病毒颗粒似乎和溶酶体共定位，这说明细胞感染后，由于和HD5的结合，改变了病毒的传输通路[7]。

此外，防御素肽对人类免疫缺陷病毒(HIV)有抗病毒活性，通过病毒和肽的直接相互作用或者抑制病毒基因组的复制来发挥抗病毒活性。由于带正电荷的HNPs和HIV包膜糖蛋白gp120的带负电荷部分之间的相互作用，防御素与HIV病毒粒子直接结合发挥抑制作用，HNP-4抑制HIV复制的活性大于HNP-1、HNP-2和HNP-3，但是目前这种相互作用的确切机制还没有被很好地阐述[11]。但是根据目前的研究，尚不清楚HNP-4的有效性是否仅通过对病毒粒子的直接作用发挥。

2 抗菌肽LL-37

抗菌肽LL-37是具有保守的100个氨基酸天主蛋白结构域的肽，属Cathelicidin家族，最初从猪白细胞中发现，是一种组织蛋白酶抑制素类抗微生物肽，Cathelicidin是一种典型的线性肽，可以折叠成两亲的α-螺旋结构，常被从高度可变的C端抗菌结构域剪切[12]。研究表明，抗菌肽LL-37作用广泛，除广谱的杀菌作用外，还表现除对有包膜病毒的抗病毒活性，并且在细胞凋亡过程中起着重要的免疫介导作用[13-14]。

2.1 抗菌肽LL-37的抗病毒作用

抗菌肽LL-37(Cathelicidin LL-37)对多种病毒有抗病毒活性，包括IAV、HIV-1、RSV、鼻病毒(HRV)、痘苗病毒(VACV)等，主要是通过肽与病毒外膜相互作用发挥抗病毒活性[13]。LL-37在发挥抗病毒活性时，一次性去除病毒的外膜，这说明LL-37作地毯式直接杀伤病毒，保持膜的完整性，直到肽浓度达到阈值，快速分解目标膜。

2.2 LL-37的抗病毒应用与机制

LL-37直接与包膜和蛋白衣壳相互作用发挥其抗病毒活性。例如，LL-37对A型流感病毒的治疗活性在体内和体外均已得到证实，LL-37已被证实对A型流感病毒(IAV)在体内体外均有治疗活性，在体内，IAV引起先天免疫反应后，在呼吸道中遇到LL-37，并从中性粒细胞、巨噬细胞和上皮细胞中分泌[14]。在早期研究中，使用小鼠IAV菌株评估LL-37的体内抗病毒活性，LL-37降低了IAV感染的严重程度，通过免疫测定发现，LL-37还降低了炎症细胞因子的表达，特别是IL-1β、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、角质形成细胞趋化因子(KC)[15]。在IAV感染期间，在体外使用LL-37治疗并不能阻断病毒的入侵，LL-37在病毒侵入后、RNA或蛋白质合成之前抑制IAV的复制，病毒载量的降低、上皮细胞的直接抗病毒作用和炎症因子的表达都以一种剂量依赖的方式与LL-37的活性有关，试验数据还表明，LL-37通过调节固有免疫细胞，特别是中性粒细胞，参与宿主对IAV的防御[15]。通过使用LL-37治疗流感感染个体、或者通过增加IAV感染肺部的天然抗菌素的表达，可以对IAV有显著的保护作用[14-15]。

LL-37还可以抑制牛痘病毒(VACA)的复制，并且可以改变病毒膜。牛痘病毒是一种可以感染多种哺乳动物细胞的DNA病毒，研究发现，小鼠LL-37在感染期间对VACA表现出了良好的疗效和保护作用，使用LL-37(25 μmol/L～50 μmol/L)预孵育细胞，VACA基因的表达和病毒滴度均以剂量依赖的方式降低[16]。透射电镜图像显示，使用LL-37孵育24小时后，VACA病毒膜的完整性被破坏[16]。

研究表明，LL-37对外周血中单核细胞中人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)有保护能力。LL-37通过蛋白与蛋白直接的相互作用，以剂量依赖的方式直接抑制HIV-1逆转录酶的活性(IC50=15 μmol/L)[17]。该小组研究人员测试发现，LL-37对HIV-1蛋白酶也有抑制作用，但是相对于抑制HIV-1逆转录酶，这种活性较弱(LL-37浓度为100 μmol/L时抑制20%～30%)，同时，接受过抗逆转录病毒治疗的HIV阳性个体的血浆中LL-37含量明显高于未接受抗逆转录病毒治疗的患者，其继发感染的易感性也相对应增加[17]。

3 转铁蛋白类

乳铁蛋白(lactoferrin，LF)是转铁蛋白家族中抗病毒活性最显著的抗菌肽，是一种80 ku的多功能糖蛋白，最初在牛奶中发现，它高度保守，可以在人类、鼠和猪中发现，在大多数生物液体中表达，如外分泌的分泌物(牛奶、唾液、消化道液体和眼泪)和中性粒细胞颗粒中表达[18]。LF是先天免疫防御的关键组成部分，通过直接作用于病原体膜和目标宿主细胞部分以及通过调节炎症，证明了其抗菌抗病毒的活性。

3.1 乳铁蛋白的抗病毒作用

LF是一种非血红素铁结合糖蛋白，其表达可以被乳腺上皮细胞在激素的控制下诱导，或者在明确的细胞周期阶段表达，如中性粒细胞分化时。在结构上，LF由一个多肽链组成，具有高度碱性和带正电荷的N端区域，LF的三级结构折叠成两个球状叶，由3个旋转的α-螺旋连接，每个叶包含1个铁离子的结合位点，当铁结合时，2个叶之间存在强烈的相互作用，这使得LF能够抵抗蛋白质水解[19]。在胃中，酸性蛋白酶水解LF的N端生成乳铁蛋白肽(Lfcin)，这是一种含有25个氨基酸的多肽，具有多个疏水、带正电荷的残基[18-19]。Lfcin保留了LF的特性，表现出有效的抗病毒活性。

3.2 乳铁蛋白的抗病毒应用与机制

乳铁蛋白能够阻挡病毒粒子进入靶细胞。例如，早期研究表明，LF在体外具有直接抗呼吸道合胞体病毒(RSV)的活性，在HEp-2细胞中，LF(100 μg/mL) 与病毒粒子孵育后，减少了由于RSV感染诱导的IL-8的产生[20]。这种LF介导的抑制依赖于LF和RSV之间的相互作用，LF抑制了RSV进入HEp-2细胞，通过使用LF(100 μg/mL)与RSV的预孵育可以减少病毒的进入，LF可以直接结合RSV F蛋白的F1亚基，导致病毒粒子与细胞膜的融合，从而抑制RSV的进入[21]。

乳铁蛋白对腺病毒(HAdV)的抗病毒活性发生在感染期间的多个阶段。在一项研究中，LF在感染的不同阶段抑制了HAdV的复制，在感染前引入肽，或者是病毒感染后引入肽，以及在整个试验过程中引入肽，LF均抑制了HAdV的复制，这表明LF可能涉及多个作用机制，牛LF也以剂量依赖的方式证明了抗HAdV的特性，当病毒与LF(1 mg/mL)预孵育时，牛LF表现出最大的抑制作用，后续通过电子显微镜成像，验证了LF与HAdV的结合[20-21]。

4 抗菌肽在临床应用中的治疗潜力及挑战

4.1 抗菌肽抗病毒在临床应用中的治疗潜力

近年来，无论是天然存在、还是合成的抗菌肽的抗病毒特性以及它们的治疗潜力，引起了学术界和制药界越来越多的兴趣。许多最初被认为仅具有抗菌活性的抗菌肽，已经发现具有抗病毒和免疫调节的功能。抗菌肽疗法很少得到临床批准，到目前为止，在临床试验中仅研究了少数的抗菌肽作为治疗剂的适用性和功效、作为治疗感染和免疫调节的药物。利用抗菌肽的临床研究已经开始试验，例如用于治疗耐药性肺炎克雷伯菌的防御素模拟化合物(CTIX 1278)，用于革兰氏阴性细菌性皮肤感染和阳性细菌感染的α-螺旋AMP (PL-5)，以及用于皮肤性皮炎的阳离子肽(DPK 060)[21]。抗菌肽由于其相对较低的毒性和体内耐受性，成为一种很有前途的治疗方法。α-MSH先前已证明具有抗HIV的抗病毒活性，这种临床试验上的治疗形式可发展为一种经济而且有效的减少HIV传播的策略[13]。抗菌肽可以通过多种方式进行输送，包括静脉内注射、口服给药等。在呼吸道感染试验中，联合抗菌肽治疗，如防御素和LL-37可以在肺部提供保护，在感染IAV之前，给小鼠注射LL-37可以降低疾病的严重程度，从而提高小鼠的存活率[15]。同样，对其他呼吸道病原体也适用，例如RSV和鼻病毒，使用乳铁蛋白和神经霉素，通过加入抗菌肽，都已证明对RSV有疗效[14-15]。

4.2 抗菌肽抗病毒在临床应用中的挑战

尽管使用抗菌肽作为抗病毒治疗方法拥有巨大的吸引力和一些成功的体外结果，但距离广泛应用抗菌肽作为治疗方法仍然面临着许多挑战。目前，关于抗菌肽的使用、毒性、疗效、给药方法、宿主摄取以及抗菌肽在体内的反应的临床数据都很少，还不足以指导抗菌肽发展成为治疗产品，根据目前的实验室研究结果来看，尚不确定抗菌肽的体外抗病毒活性是否能够转化为体内抗病毒活性，以及能够在多大程度上转化为体内抗病毒活性。此外，对于许多抗菌肽来说，尚不清楚体外试验中使用的肽浓度和体内活性需要的安全生理有效浓度之间的关系。例如，试验中的环境和条件对抗菌肽活性的发挥存在影响，据报道，在体外模拟的生理环境下，有几种抗菌肽对A族链球菌无效，这可能是因为试验中生理离子环境在实验室中并没有被完全模拟[22]。在其他研究中发现，体外检测中最低活性的抗菌肽浓度，在体内给药时能够有效控制感染，这说明实验室试验所得的体外数据与感染动物模型的抗菌肽剂量和疗效之间缺乏明确的相关性[ 22]。使用抗菌肽作为抗病毒治疗方法，还需要进一步研究抗菌肽的体外抗病毒活性与其转化为体内疗效之间的相关性，以进一步发展使用抗菌肽作为一种新型抗病毒治疗的手段。

抗菌肽的分离和大规模制造是使用抗菌肽作为抗病毒治疗方法的另一个重要挑战。在生产上，高成本限制了抗菌肽的临床适用性，商业规模制造成为严峻问题。抗菌肽的活性是基于其本身结构的，抗菌肽本身复杂的二级结构也是大规模生产的障碍。在天然抗菌肽方面，研究人员致力于发现并应用不同来源的抗菌肽，例如，同人源LF相比，牛LF更易于大量生产，且表现出同等甚至更强的功效，不同来源的抗菌肽可能会有不同的活性[18]。合成抗菌肽是一种实用的替代品，但是它们的生产成本很高，投入到临床用于治疗还需要开发新的合成方法。目前，几种系统已经可以大规模生产抗菌肽，包括哺乳动物细胞和转基因植物，表达系统的使用可以大量生成“正确折叠的肽”，但生成的肽在这些系统中很容易被蛋白降解[21]，抗菌肽要成为可行的临床治疗药物，必须克服这些生产上的问题。尽管使用哺乳动物细胞培养系统生产抗菌肽是更好的选择，但是从经济方面考虑，并不适用，对于生产商业规模的抗菌肽来说，植物生物反应器是一种经济有效的方法，具有适用性。使用药物诱导来增加抗菌肽的表达得到了广泛关注，例如在临床上已经得到证实，维生素D可以诱导LL-37的产生[22]。

抗菌肽的代谢稳定性可能会限制其未来的临床应用。目前，评估抗菌肽药物代谢动力学的数据还比较少，抗菌肽的生理半衰期、必要的给药方案以及肽在体内的聚集等问题有待进一步研究。例如，口服和外用制剂中的抗菌肽会受到酶的降解、pH和离子浓度的变化的影响，肽在输送时也会面临皮肤、肠道、鼻黏膜的渗透和摄取等障碍，抗菌肽通过静脉注射的方式给药也会受到血浆和组织中酶的蛋白降解作用，一些抗菌肽对盐或血清敏感，大幅度降低其本身活性，进一步限制了抗菌肽作为临床治疗方法的适用性[22]。

将高剂量抗菌肽的引入体内的方式，还需要进一步的研究。向感染部位输送足够剂量的抗菌肽，需要进一步地校准剂量，例如：当使用涂抹制剂时，在皮肤上使用抗菌肽制剂需要通过涂抹药膏完成，与此同时对所用抗菌肽引起的过敏和过敏症状发展问题，还需要进一步的研究和完善[23]。抗菌肽要在众多反馈途径的存在下发挥活性，共同将抗病原体反应校准到适当的水平，还需要进一步确定在感染和治疗过程中，高剂量抗菌肽与这些途径的相互作用。

尽管抗菌肽的临床应用受到以上限制，但通过创新配方可以加快将抗菌肽产品推向临床阶段的过程。使用纳米颗粒(NPs)作为递送载体可以大大改善抗菌肽代谢的稳定性，纳米颗粒可以提供独特的优势，例如保护抗菌肽免受蛋白降解、控制肽的释放速率[24]。目前，已经有研究评估了几种纳米颗粒作为载体对抗菌肽的递送效果，自组装透明质酸(HA)纳米凝胶已经用于通过肺内感染的气管给药成功递送LLLKKK18(LL-37的类似物)给小鼠，HA纳米载体能够在体外稳定肽并能降低巨噬细胞中肽的细胞毒性，聚乳酸-乙醇酸(PGLA)NPs也成功地用于输送阳离子抗菌肽[25]。虽然这些表述仅在体外进行试验和在实验动物模型中研究，但从研究结果来看，未来基于AMP的疗法拥有巨大的潜力和价值。