木蝴蝶活性成分质量控制研究进展*

程新杰，卞广利，李德强，闫凯，徐艳梅，高燕霞

(1.河北省药品医疗器械检验研究院，石家庄 050011；2.河北医科大学第二医院药学部，石家庄 050000)

木蝴蝶为紫葳科植物木蝴蝶属木蝴蝶Oroxylumindicum(L.)Vent的干燥成熟种子，又称千层纸、玉蝴蝶等，其广泛地分布于亚洲国家[1]。现代药理学研究表明，木蝴蝶具有抗氧化、抗菌、抗炎、镇痛、抗癌、降糖、抗诱变等多种生物活性[2-6]；植物化学研究表明，其主要成分为黄酮类化合物，是其发挥生物活性的主要成分[6-7]。然而，木蝴蝶化学成分复杂、活性物质含量较低，且共存大量的干扰物质[8]。因木蝴蝶分布广泛、来源复杂，生长环境、产地气候、采收时期及储藏方法等不尽相同，其活性成分必然存在很大差异，使木蝴蝶活性成分的全面质量控制成为研究难点和热点。近年来，随着科技的进步及对天然药物研究的重视，出现许多新兴分析技术，使中药活性成分的质量控制得到了长足的发展，对天然药物的研究也越来越深入。本文查阅近年来国内外木蝴蝶的研究文献，对木蝴蝶活性成分的质量控制做一综述，以期为木蝴蝶的开发和临床应用提供参考。

1 木蝴蝶活性成分

植物活性成分指构成植物体内的物质，除水分、蛋白质、脂肪酸等必要物质外，还包括其次生代谢产物，如萜类、黄酮类、生物碱、甾体类等。现代研究表明，木蝴蝶中含有多种活性成分，其中黄酮类化合物是其主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌等广泛的生物活性。目前，已知木蝴蝶中黄酮类化合物有木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、黄芩素、黄芩苷、白杨素、千层纸素A、木蝴蝶定、粗毛豚草素、白杨素-7-O-β-D-龙胆二糖苷、5，6-二羟基-7-甲氧基黄酮等30余种。其中，木蝴蝶苷B是木蝴蝶药材中的特有成分，目前在其他药材中尚未发现。木蝴蝶苷C和木蝴蝶苷D[9]、orlumin A[10]、oroxylumosides A和B[11]是近年来从木蝴蝶植物中最新分离得到的黄酮类化合物。木蝴蝶中除了含有黄酮类化合物外，还含有具有多种药效作用的其他类成分，如红景天苷、麦角甾苷、洋丁香苷等对羟基苯乙醇化合物，连翘环己醇、异连翘环己醇、5，6-二氢化-7-羟基-棘木苷等环己醇类化合物，2'，3'-二氢-2'-甲基-2'-十二烷基-2，3-呋喃妥因紫檀碱、2'，3'-二氢-2'-庚基-2，3-呋喃-8-羟基紫檀碱、2'，3'-二氢-2'-己基-2，3-呋喃-8-羟基紫檀碱等紫檀碱类化合物，丁基羟基甲苯、苯乙酮、2，3，6-三甲基吡啶等挥发性成分，油酸、棕榈酸、硬脂酸等有机酸类化合物[12-14]；VIEN等[15]从木蝴蝶茎皮中分离出Oroxindols A 和B两种新型癸二烷二萜化合物。在上述活性成分中，含量较高且研究较多的一类化合物是黄酮类化合物。

2 质量控制研究

《中华人民共和国药典》2020版采用高效液相色谱法，以单成分木蝴蝶苷B作为含量测定的指标用于木蝴蝶的质量控制。除此之外，指纹图谱技术、液相色谱(LC)及液相色谱-质谱技术(LC-MS)、一测多评技术等也被广泛应用于木蝴蝶的质量控制。

2.1LC法 LC法简单、准确、灵敏、精密度高、重复性好、自动化程度高，已被广泛地应用于木蝴蝶的分析检测。

SINHA等[16]通过HPLC指纹分析结合单标记物多组分定量分析(quantitative analysis of multi-components by a single marker，QAMS)，以黄芩素为内标，同时测定了木蝴蝶中野黄芩苷、高车前素、黄芩素和Biochanina-A四种化合物的含量。实验结果显示，QAMS法与传统的外标法(external standard method，ESM)之间差异无统计学意义，这表明，在没有多种对照品的情况下，QAMS法是一种可用于测定多种成分含量的一致且简便的方法。此外，该方法的线性关系、精密度、稳定性、回收率和重复性也得到了很好的验证，可有效地应用于木蝴蝶的质量评估。

SITHISARN等[17]建立了同时测定木蝴蝶中三种主要黄酮类成分的HPLC法，色谱柱为X-terra C18(150 mm×3.9 mm，5 μm)，流动相为0.01%磷酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，在285 nm处进行检测，测定结果显示黄芩苷、黄芩素和白杨素的线性范围分别为1.04～104，1.08～108，1.12～112 μg·mL-1，相关系数均≥0.999 0，回收率在90%～101%，RSD<2%，系统适应性参数均符合要求，该方法快速、简便、准确性高、重复性好，适用于木蝴蝶果实及种子中黄芩苷、黄芩素和白杨素的同时定量测定，可为木蝴蝶的全面质量控制提供实验依据和理论基础。

ROJSANGA等[18]通过HPLC法研究了采用植物组织培养技术培养的木蝴蝶植物组织三个不同生长阶段(4 d、3周和9周)和原生木蝴蝶种子提取物中的三种主要黄酮类成分(黄芩苷、黄芩素和白杨素)的含量。实验结果显示，在三种黄酮中，黄芩苷含量最高，其次是白杨素，而黄芩素的含量最低。值得注意的是，黄芩苷和白杨素含量在组织培养植物根和子叶的发育过程中保持较高水平，但当真叶开始生长时，其含量下降，而黄芩素则在各个生长阶段保持稳定。此外，所建方法的线性、精密度和重复性也得到了验证。研究结果表明，该方法简单、快速，可用于木蝴蝶提取物中三种黄酮类化合物的定量分析，同时，这种基于不同生长阶段的分析方法可为木蝴蝶的进一步开发和质量控制提供参考。

2.2LC-MS法 LC-MS法集色谱分离系统和质谱检测系统为一体，具有高通量、高灵敏度、高准确性、高选择性及高稳定性的特点，适用于中药复杂体系中成分的定性定量分析。

魏欣等[19]建立了超高效液相色谱-质谱串联(UPLC-MS/MS)法对木蝴蝶中木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、槲皮素、黄芩苷、黄芩素、高车前素、芹菜素、野黄芩素、白杨素、金丝桃苷10种主要成分同时进行测定。采用Inertsutain C18(100 mm×3.0 mm，2 μm)色谱柱，柱温40 ℃，流动相为乙腈(A)-甲醇(B)-0.5%甲酸水(C)，梯度洗脱，流速为0.5 mL·min-1，负离子多反应监测模式。结果表明所测的10种主要成分在各自线性范围内线性关系良好，相关系数均大于0.996 6，精密度、重复性与稳定性良好，平均加样回收率为94.0%～104.5%，RSD≤3.21%。该方法简单、快速、灵敏度高、专属性强，适用于木蝴蝶的质量控制。

何民友等[20]采用超高效液相色谱三重四级杆质谱联用方法，建立木蝴蝶配方颗粒的特征指纹图谱，并进行含量测定。采用Agilent SB C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，流动相分别为乙腈-0.01%甲酸和乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脱，流速为0.28 mL·min-1，柱温设为30 ℃，检测波长为276 nm，结果显示16批木蝴蝶配方颗粒和共有模式的相似性良好，相似度大于0.90，6种成分在各自测定范围内呈良好的线性关系，平均加样回收率在95.6%～102.8%，该方法可用于木蝴蝶配方颗粒快速、全面、有效的质量控制。

吴茵等[21]采用UPLC-Q-TOF-MS技术结合Peakview数据分析平台对木蝴蝶中黄酮类化合物进行了快速地定性分析，色谱条件为Kinetex-XB C18色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)，以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，流速为0.25 mL·min-1，采用负离子检测模式，共分离和鉴定出36个黄酮类化学成分，其中包括10种黄酮苷元及26种黄酮苷类成分，该方法快速、准确，可为木蝴蝶化学成分的鉴定提供一种新策略，同时也为木蝴蝶的进一步质量控制提供技术支持。

PENG等[22]建立了HPLC和LC-ESI-qTOF-MS/MS相结合的分析方法对木蝴蝶中化学成分进行鉴定，并同时测定木蝴蝶中6种主要活性成分的含量。首先，通过LC-ESI-qTOF-MS/MS法对42个成分进行鉴定，其中包括23种黄酮苷类成分、13种黄酮类成分和6种其他化合物；然后确定了指纹图谱中19个共有峰的17个特征成分；最后采用液相色谱-紫外检测(LC-UV)法同时测定6种主要活性成分。使用Waters Symmetry C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，0.1%甲酸水(A)和乙腈(B)为流动相，以0.8 mL·min-1的流速进行梯度洗脱，柱温为35 ℃，检测波长为280 nm，在负离子模式下进行。结果显示，6种组分的标准曲线在测试范围内线性良好，相关系数均大于0.999 8，该方法快速、高效，可用于木蝴蝶的全面鉴别与质量评价。

陈丽娜等[23]通过HPLC-DAD-ESI-MS技术对木蝴蝶甲醇提取物中的主要化学成分进行定性分析，使用Waters SunFire C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，采用以下条件进行样品分析：柱温为40 ℃，流动相为乙腈-纯水(梯度洗脱)，流速为0.5 mL·min-1，检测波长为360 nm，负离子检测模式。通过HPLC的分离、DAD 检测器和电喷雾质谱法的结构确认以及色谱图和质谱数据与参考文献的对比，共指认了木蝴蝶苷B、2α，3β-二羟基羽扇豆醇、黄芩苷、腺苷、白杨素-7-葡萄糖酸苷、黄芩苷元、羽扇豆醇和白杨黄素等8个重要的化合物，该方法操作简单，分析快速，可用于木蝴蝶中化学成分的鉴定，并为木蝴蝶的质量控制提供数据支持。

2.3气相色谱-质谱(GC-MS)法 GC-MS法结合GC分离和MS结构解析，通过碎片分布进行定性定量分析，专属性强、选择性高、灵敏度高、检出限低、检测范围广、分析速度快，对于中药等复杂的样品检测具有很大优势。王义梅等[14]采用GC-MS技术测定了木蝴蝶果实不同组织的挥发性成分，采用HP-5 色谱柱(30 mm×0.25 mm，0.25 μm)，程序升温，载气流速为1 mL·min-1，质量扫描范围为40～800 amu。通过计算机标准质谱图库(NIST2002)检索结合参考文献的比对，在木蝴蝶果实各组织中共测出丁基羟基甲苯、丁基-3-庚烷基-邻苯二甲酸酯、苯乙酮、苯基乙醇、4-甲氧基苯乙酮、4'-羟基苯乙酮、6-Octadecenoic acid和柠檬酸丁酯等8种主要成分，且在各个组织中，以丁基羟基甲苯的含量最高。该方法简单、高效，可用于木蝴蝶中挥发性成分的检测，并为木蝴蝶资源的进一步开发利用和质量控制提供依据。

2.4基于药理活性的绿色质量控制 鉴于中药材质量控制所需仪器设备昂贵、质量控制指标少、有机溶剂易对环境造成污染等缺点，有必要进行基于药理活性的“绿色”质量控制研究。在已知木蝴蝶中的4种主要黄酮类化合物木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、黄芩素和白杨素具有酶抑制活性[24-25]的前提下，YIN等[26]以这4种主要的黄酮类成分为质量控制指标，建立了一种简单、绿色、快速的木蝴蝶质量控制方法。实验以低共熔溶剂(Deep eutectic solvents，DES)氯化胆碱/1，4-丁二醇(1：3)为绿色提取液，采用组织破碎提取技术(tissue-smashing extraction，TSE)对木蝴蝶中活性成分进行超快速提取，并结合超高液相色谱-紫外检测(UPLC-UV)方法对四种主要的黄酮类化合物进行定量分析。与常规方法相比，这种基于DES的TSE结合UPLC-UV技术大大缩短了提取时间、提高了提取效率、降低了能耗，而且减少了环境污染。此外，所建立的UPLC法具有良好的线性，准确度和精密度。因此，该技术可作为一种简单、可靠、高效、灵敏的方法，用于木蝴蝶的绿色质量控制。

3 结束语

现代药理学研究表明，中药木蝴蝶具有多种显著的药理作用，是重要的药食两用物质，有望成为治疗心血管疾病、糖尿病、肿瘤等的药物或被开发为抗衰老和功能保健类药物，其社会效与经济效应前景广阔。因此，十分有必要对其质量进行严格的把控。相信随着对天然产物研究的不断深入及科技的不断革新，会出现更多简便、高效、快速、准确的分析技术用于木蝴蝶的全面质量控制研究，为木蝴蝶的进一步开发和临床应用提供参考，同时也为开发安全高效的创新药物奠定基础。