不同产地黄精多糖含量、多糖红外光谱及抗氧化活性研究*

贺维涛 年婧 赵重博

(1.泾阳县医院，陕西 咸阳 713700；2.陕西中医药大学第二附属医院，陕西 咸阳 712000；3.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)

黄精为百合科植物滇黄精PolygonatumKingianumColl.et Hemsl.、黄精PolygonatumsibiricumRed.或多花黄精polygonatumcyrtonemaHua.的干燥根茎。黄精属植物在我国分布很广，大约有40余种，但适应性较差，生境选择性强[1]。其中黄精主要分布在陕西、河北、内蒙古等省；多花黄精在南方地区分布最多，主要集中在湖南、湖北、安徽、浙江等省；滇黄精主要分布于云南、贵州及四川[2-4]。

自古黄精就被认为是药食同源之品，久服可轻身不老益寿延年，随着健康中国2030规划纲要的推进，人们保健意识逐渐增强，具有保健功能的中药的市场需求越来越大，黄精因其良好的药用价值和丰富的生物活性成为食品、医药等领域开发和研究的热点中药。本研究通过测定9个产地3个不同基源黄精的多糖性质，为黄精的产品开发提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 SHB-3循环水式多用真空泵(河南予华仪器有限公司)；UV2550 型紫外分光光度计(日本岛津科学仪器有限公司)；RE-52AA 旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱(上海合恒仪器设备有限公司);GB5374-91型电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；中草药粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)；HH-X型数显电热恒温水浴锅(北京科委永兴仪器有限公司)；Tensor-27型-傅里叶变换红外光谱仪(德国布鲁克公司)。

1.2试药 黄精药材分别来自安国市场、玉林市场、荷花池市场和陕西汉中略阳县，经王昌利教授鉴定为百合科黄精属植物黄精PolygonatumsibiricumRed.的干燥根茎(见表1)。石油醚、95%乙醇、无水乙醇、浓硫酸、溴化钾(天津市天力化学试剂有限公司)；蒽酮(国药集团化学试剂有限公司)；葡萄糖标准对照品(纯度≥99%，批号：140974-110833，中国食品药品检定研究院)；木瓜蛋白酶(含量98%，比活力 0.5～2 U·mg-1，批号：P3250，美国Sigma-Aldrich 公司)；Vc标准对照品(纯度≥99%，批号：S05J6G1，上海源叶生物科技有限公司)；DPPH标准对照品(Diybio生物科技有限公司)。

表1 样品来源

2 方法

2.1黄精总糖含量测定 参考2020年版《中国药典》黄精药材含量测定项下多糖含量的测定方法[5]。

2.1.1对照品溶液的制备 称取105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品适量，精密称定，置于100 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，得浓度为0.33 mg·mL-1对照品储备液。

2.1.2标准曲线的制备 分别精密移取该储备液0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL 置于10 mL 具塞试管中，分别加水至2.0 mL，各加入0.2% 蒽酮-硫酸试液至刻度，摇匀，水浴保温10 min，取出置于冰水浴冷却10 min，取出，于582 nm处测定吸光度A，以A为纵坐标，对照品质量浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线。

2.1.3黄精总多糖含量测定 分别取不同产地黄精药材粉末0.25g(过四号筛)，精密称定，置圆底烧瓶中，加80%乙醇150mL，置水浴中加热回流1 h，趁热滤过，残渣用80%热乙醇洗涤3次，每次10 mL，将残渣及滤纸置烧瓶中，加水150 mL，置沸水浴中加热回流1 h，趁热滤过，残渣及烧瓶用热水洗涤4次，每次10 mL，合并滤液与洗液，放冷，转移至250 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取l mL，置10 mL具塞干燥试管中，0.2% 蒽酮-硫酸试液显色后于582 nm处测定吸光度，计算总多糖含量。

2.2黄精多糖制备

2.2.1黄精粗多糖制备 取黄精药材粉末500 g(过60目筛)，加400 mL石油醚脱脂8 h。纱布过滤，药渣加20倍蒸馏水，煎煮两次，每次2 h，过滤后滤液合并，常压浓缩冷却至常温并定容至1000 mL，即得总多糖提取液。加入无水乙醇，使乙醇体积分数为80%，摇匀，醇沉液置常温环境中静置20 h，抽滤收集沉淀，干燥，得黄精粗多糖，记录重量[6]。

2.2.2除蛋白 取黄精粗多糖10 g加超纯水充分溶解，加入相当于粗多糖质量的1%的木瓜蛋白酶，在55℃水浴反应2 h，反应结束后用沸水煮5 min灭活木瓜蛋白酶，酶解液离心(4000 r·min-1，5 min)，收集上清液后减压浓缩，体积比5∶1加入Sevage试剂(三氯甲烷-正丁醇=4∶1)振荡20 min，然后静置10 min，4000 r·min-1离心10 min。弃去中间层和下层物质，反复5～6次，紫外分光光度计检测260～280 nm吸收波长至无吸收，旋蒸除去残留的Sevage试剂，缓慢加入无水乙醇，使乙醇体积分数为80%，摇匀，醇沉液置常温环境中静置20 h，抽滤收集沉淀，干燥，得黄精多糖，记录重量[7-8]。

2.3黄精多糖红外检测 分别取不同产地黄精多糖样品，以 1∶200 比例同溴化钾混合后，在玛瑙研钵中磨至约200目粉末，在红外压片机上制成透明薄片，采用红外光谱仪，在范围为 4000～400 cm-1，共扫描 20次，分辨率为 2 cm-1。以纯溴化钾得到的红外光谱图作为背景[9-10]。

2.4黄精多糖抗氧化活性

2.4.1DPPH溶液的配制 称取DPPH试剂适量，精密称定，置于100 mL棕色容量瓶中，用无水乙醇溶解，并定容至刻度线，摇匀，即得浓度为0.04 mg·mL-1溶液。

2.4.2Vc溶液的配制 称取Vc对照品适量，精密称定分别置于5 mL棕色容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容至刻度线，摇匀，分别制成0.5 mg·mL-1、1 mg·mL-1、2 mg·mL-1、4 mg·mL-1、8 mg·mL-1、10 mg·mL-1的对照品溶液。

2.4.3黄精多糖供试品溶液的配制 称取各种黄精多糖适量，分别置于5 mL容量瓶中，用纯水溶解并定容至刻度线，摇匀，分别制成0.5、1.0、2.0、4.0、6.0和8.0 mg·mL-1的供试品溶液。

2.4.4DPPH自由基清除率测定 分别吸取不同浓度的阳性对照品Vc溶液(以无水乙醇为空白)与供试品溶液(以水为空白)，各0.2 mL置于10 mL具塞刻度试管中，再加7.8 mL的DPPH溶液，摇匀，在室温下反应30 min，于紫外分光光度计515 nm处测定吸光度。依公式计算DPPH清除率[11-13]。

DPPH自由基清除率=(1-Ai/AO)×100%

注：Ai.样品加DPPH溶液的吸光度；AO.空白溶液加DPPH溶液的吸光度

3 结果

3.1黄精多糖测定结果 葡萄糖回归方程A=0.5065C+0.017(r=0.9993)，标准曲线见图1，表明葡萄糖质量浓度在0.33～1.98 mg·mL-1范围内与吸光度A呈良好线性关系。黄精多糖测定结果见表2。

图1 葡萄糖浓度标准曲线

由表2得，9种不同产地黄精的多糖存在明显的差异，其总糖含量由大到小为4(云南)>1(河北)>7(广西)>3(湖南)>5(贵州)>6(四川)>2(江西)>9(陕西)>8(湖北)。

表2 不同产地黄精多糖含量测定结果

粗多糖含量由大到小为4(云南)>1(河北)>6(四川)>9(陕西)>2(江西)>5(贵州)>7(广西)>3(湖南)>8(湖北)。

多糖含量由大到小为1(河北)>4(云南)>9(陕西)>6(四川)>7(广西)>2(江西)>3(湖南)>5(贵州)>8(湖北)。

3.2红外测定结果 红外测定结果见图2，不同产地黄精多糖的红外光谱在3600～1200 cm-1处基本相似，说明具有相似的官能团。在3400 cm-1和2900 cm-1附近处出现吸收峰，说明在多糖中含有-OH伸缩震动吸收峰和C-H伸缩震动吸收峰，这两个吸收峰均为多糖的典型吸收峰，1600 cm-1附近处是C=O的吸收峰，在1400～1200 cm-1是C-H的变角振动引起的吸收峰。

图2 不同产地黄精多糖红外光谱堆积折线图

在红外光谱指纹区存在个别差异，在1100 cm-1处出现吸收峰，含有吡喃环结构，890 cm-1处的吸收峰说明具有β糖苷键，830 cm-1处的吸收峰说明具有α糖苷键。其余产地黄精多糖仅有β糖苷键，无α糖苷键吸收；湖南和湖北黄精多糖同时含有β糖苷键和α糖苷键[14-16]。

3.3抗氧化活性测定结果 不同产地黄精多糖样品抗氧化结果见图3，多糖浓度与DPPH清除率存在一定的量效关系，高浓度DPPH清除率贵州>河北>四川>江西>陕西>云南>湖南>广西>湖北，其中贵州黄精多糖高浓度的DPPH清除率和Vc的效应相似。

图3 不同产地黄精多糖抗氧化活性结果

4 讨论

黄精多糖是黄精的主要成分，是其抗疲劳、抗氧化作用、延缓衰老的主要活性物质，不同产地黄精的多糖含量有一定差异，目前黄精的含量测定方法均是通过蒽酮硫酸法检测，多糖被硫酸水解为单糖，单糖在硫酸作用下脱水生成糠醛，糠醛与蒽酮作用形成一种蓝绿色的络合物，在620 nm处有最大吸收。但是此法无法排除寡糖和单糖的影响[17-18]。文中检测结果提示：云南产黄精总糖含量最高，达到16.01%，远高于2020版《中国药典》7%的含量要求，同时其粗多糖含量12.56%，也位居第一，但其多糖含量却不及总糖含量较之略少的河北产黄精，可能与不同产地黄精含有的单糖及蛋白成分含量差异有关。

红外结果表明不同产地多糖的官能团基本一致，都包含O-H振动吸收峰，亚甲基C-H振动吸收峰，C-H的变角振动，吡喃环的醚键C-O-C振动吸收峰，湖南和湖北的黄精多糖所含官能团与其他产地有一定差异。抗氧化活性测定结果表明贵州黄精效果最好，也符合民国《药物出产辨》及近现代认为贵州产黄精品质优良的观点[19-20]。