西藏石榴野生群体的SSR遗传多样性分析

葛大朋，任 媛，赵 俊，王玉婷，刘学庆，苑兆和*

(1.南京林业大学，南方现代林业协同创新中心，南京林业大学林学院，江苏 南京 210037；2.西藏自治区林木科学研究院，西藏 拉萨 850000；3.山东省烟台市农业科学研究院，山东 烟台 265500)

石榴(Punicagranatum)栽培历史悠久，种质资源丰富，在我国经过长期驯化栽培，目前形成了山东、陕西、河南、云南、安徽、新疆等几大石榴栽培区，品种超过230个[1]。中国石榴种质资源丰富，快速评估种质资源的遗传多样性和遗传结构，对于促进石榴种质创新和品种改良具有重要意义。分子标记可有效揭示种质遗传多样性和种间亲缘关系，SSR(simple sequence repeat)标记具有分布广、共显性遗传和重复性好等优点，已成为一种理想的分子标记。赵丽华等[2]采用6个ISSR标记，对中国主产区的47份石榴品种遗传关系进行分析，结果表明石榴品种间存在比较丰富的遗传变异；张四普等[3]利用SRAP技术对23个石榴基因型进行了分析，结果表明石榴基因型有着丰富的遗传多样性，聚类分析将石榴品种分为5个亚群；洪文娟等[4]通过从‘泰山红’基因组中开发SSR标记，并从中筛选出15对多态性较高的SSR标记引物；Hasnaoui等[5]采用SSR标记分析了来突尼斯石榴品种的遗传多样性，结果显示微卫星标记的多态性较低，反映来自突尼斯的石榴品种遗传多样性较低，遗传背景相似；Luo等[6]采用13对多态性SSR引物，对136份国内外石榴种质的遗传多样性和群体结构进行了研究，其群体结构分析将供试种质划分为3个类群。目前国内石榴的遗传多样性研究主要以栽培石榴种质为研究对象，而野生石榴的遗传多样性研究较少。

西藏地区石榴主要分布于三江流域的芒康、左贡等地，常生于海拔1 700～3 000 m的河谷、山坡、阶地和村庄附近，属野生状态，树龄大小不一，有200多年的老树，品质差，多数属酸石榴[7]。段盛烺等[8]曾于20世纪80年代的西藏果树资源考察中，在三江流域发现有成片野生状态的石榴林的存在。李乡旺等[9]也于1991年报道了在三江流域上游人迹罕至地区分布有大片野生石榴林。由中国农业科学院郑州果树研究所主持的石榴地方品种和资源的调查收集组也曾到达西藏昌都市，并发现百年以上石榴群落[10]。在巴基斯坦、伊朗、印度和土耳其等国也有关于野生石榴的研究报道，其研究内容主要涉及种质遗传多样性、果实品质及形态特征等[11-14]。而自有西藏地区存在野生石榴资源的报道以来，对于西藏野生石榴种质的遗传多样性情况目前依然未知。本课题组于2019年通过两次实地调查，在西藏昌都和林芝地区共发现有野生石榴种质存在的10个样点。样点内石榴树无人为管理迹象，为野生状态。样点内部分石榴单株树龄及冠幅较大，与栽培石榴品种树形有很大差异，且部分野生石榴树干腐朽，健康状况较差。调查的区域内获得的石榴果实口味偏酸，食用品质较差。多个采样点内，野生石榴生境范围内存在有生活垃圾与建筑垃圾等。总体而言，野生石榴的生存状况堪忧。为此本研究采用SSR分子标记对西藏地区3个野生石榴群体的遗传多样性和群体遗传结构进行研究，以期为石榴野生资源的收集、评价与合理利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

通过在西藏林芝和昌都地区进行实地调查，在10个野生石榴分布的样点采集新鲜叶片，并随即使用变色硅胶进行干燥保存，同时记录采样个体的GPS数据。本次研究共使用10个样点的42份野生石榴种质叶片作为研究材料。考虑到西藏地区野生石榴分布稀疏且不同样点存在的种质数量很不均匀，本次研究未将每个采样点种质划分为1个单独群体。按照不同样点间的距离及样点分布的聚集性，将供试种质划分为3个群体(表1)。叶巴村、普卡村和军拥村采样点20份种质划分为昌都群体(CD)，古拉乡和安巴村采样点5份种质划分为林芝a群体(LZa)，珠拉村、格布村、则拉村、邓许村和昌西村采样点17份种质划分为林芝b群体(LZb)。

表1 西藏野生石榴采样点信息

1.2 DNA提取及PCR扩增

使用Magen(广州美基生物科技有限公司，广州)生物的RaPure Plant DNA Mini Kit 试剂盒提取供试石榴野生种质叶片基因组DNA，紫外分光光度计检测DNA的纯度和浓度。

经过前期筛选得到适用于西藏石榴野生种质和国内外栽培种质遗传多样性分析的20对 SSR引物，从中挑选出在西藏野生石榴群体中具有较高多态性的13对SSR引物(表2)，其中纯数字名称引物为本研究自主开发引物。13对引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。PCR反应体系为20 μL，包括10 μL 2 ×Taqplus PCR MasterMix，1 μL 模板DNA，0.1 μL TP-M13引物，0.2 μL带有荧光基团的M13通用引物，0.3 μL反向引物，去离子水补足至20 μL。其中M13引物序列进行的荧光标记分别为FAM、HEX、TAMRA、ROX。PCR扩增程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，52 ℃复性 30 s，72 ℃延伸 30 s，95 ℃变性30 s，50 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，共20个循环；最终72 ℃延伸10 min。PCR产物由北京睿博兴科生物技术有限公司进行毛细管电泳检测。

表2 13对SSR引物序列信息

1.3 数据处理

使用GenAlEx(V 6.503)插件[15]进行SSR位点和不同野生群体的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、香农(Shnanon)信息指数(I)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、固定指数(F)等遗传多样性参数分析。AMOVA分析使用Arlequin V 3.5.2.2软件[16]完成，Permutations参数设置为1 000。利用PowerMarker V 3.25软件[17]计算位点多态性信息含量(PIC)。利用DARwin V6软件(https://darwin.cirad.fr/)进行种质的聚类分析，首先根据SSR位点数据计算相异度矩阵(dissimilarity matrix)，之后根据相异度矩阵文件构建进化树。将DARwin V6分析的结果文件导出后，在iTOL网页[18](https://itol.embl.de)绘制聚类图。采用Structure V2.3.4软件[19]进群体遗传结构分析，数据导入时设置POPFLAG为0，Burnin Period设置为100 000，MCMC迭代次数设置为100 000，其他为默认参数，群体分组数K值设置为2～10，对于每个K值，分别进行10次重复，并选择混合模型作为祖先模型。使用在线网站Structure Harvester[20](http://taylor0.biology.ucla.edu/struct_harvest)确定最优K值。最优K值的10次重复的结果使用Clumpp V 1.1.2软件[21]进行抽样整合，主要参数为：M为2，Greedy_option为2，Repeats为1 000。之后使用Distruct V 1.1软件[22]将Clumpp抽样分析结果进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 SSR位点的遗传多样性

经过GenAlex分析，得到13个SSR位点在所有供试野生石榴种质中的遗传多样性指数(表3)。13对SSR引物在42份石榴野生种质中共扩增得到44个等位基因，平均每对引物3.385个等位基因(Na)。13对SSR引物的平均有效等位基因数(Ne)、香农信息指数(I)和期望杂合度(He)分别为1.971、0.771和0.481。13对引物中引物136、99、tsh4、dbz4和149的固定指数(F)都小于0。13对引物的平均多态信息含量(PIC)在0.299(引物86)～0.591(引物tsh6)之间，平均为0.393。

表3 13个SSR位点在供试野生石榴种质中的遗传多样性指数

2.2 不同野生石榴群体的遗传多样性

3个西藏石榴野生群体的遗传多样性分析结果(表4)显示，群体LZb的遗传多样性水平较高(Ne=2.091；I=0.842;He=0.504)；群体CD的遗传多样性水平居中(Ne.1.817;I.0.600;He.0.395)；群体LZa遗传多样性水平最低(Ne=1.695;I=0.513;He=0.365)。可见野生群体之间的遗传多样性水平存在差异。3个野生群体的平均有效等位基因数(Ne)、平均香农信息指数(I)和平均期望杂合度(He)分别为1.867、0.646和0.421。3个群体中CD群体的固定指数(F)为负值，说明其观测杂合度(Ho)大于期望杂合度(He)。

表4 3个野生石榴群体的遗传多样性

2.3 3个野生石榴群体的遗传分化

AMOVA分析结果(表5)显示，野生石榴群体内遗传变异高达88.43%，群体间占有11.57%的遗传变异，整个野生群体的遗传分化系数(Fst)为0.116。同时计算不同野生群体之间的遗传分化系数(Fst)和基因流(Nm)参数(表6)。其中比较特殊的是CD群体和LZa群体之间的参数遗传分化系数(Fst)为0.229，基因流(Nm)为0.840，两群体间遗传分化程度较大。

表5 3个野生石榴群体的分子方差分析

表6 野生石榴群体间的遗传分化系数和基因流

2.4 石榴野生种质的聚类分析

基于供试石榴野生种质分子标记数据构建非加权邻接(unweighted neighbor-joining)系统发育树(图1)。结果可将所有种质划分为3个亚群，其中军拥6号单独为聚为亚群Ⅰ，4份LZb群体和10份CD群体种质聚类亚群Ⅱ，剩余种质聚为亚群Ⅲ。来自同一群体的多数种质常常聚类在一个分枝下，CD群体中除军拥6外，剩余种质集中聚类在2个分枝下(亚群Ⅱ，亚群Ⅲ)。LZa群体种质聚类在2个小分枝下，LZb群体聚类在2个分枝下(亚群Ⅱ，亚群Ⅲ)。同时来自同一采样点的部分种质也常常聚在一起，如军拥村采样点种质、叶巴村采样点种质、格布村采样点种质等。

图1 42份西藏石榴野生种质资源聚类图

2.5 野生石榴种质的遗传结构分析

使用Structure软件对42份西藏石榴野生材料的遗传结构进行分析(图2)。结果表明K=4时，ΔK最大(图2A)。根据Evanno的理论[23]，表明所有供试野生种质有4个可能的基因库。CD群体以天蓝色和绿色基因库为主，LZa群体以黄色和红色基因库为主，LZb群体以红色和天蓝色基因库为主。本研究将成员系数(membership coefficient)Q值在某一基因库中比例大于等于0.7的种质划分到对应基因库类群，认为该种质的基因来源单一。相反，成员系数在所有4个基因库中的比例都小于0.7的种质则被划入混合类群。划分的5个类群分别为红色类群(Q1)、淡绿色类群(Q2)、黄色类群(Q3)、天蓝色类群(Q4)和混合类群(mix)。统计3个野生群体分别在5个类群中的数量(表7)，红色类群有且仅含有8份LZb群体种质，淡绿色类群(Q2)有且仅含有5份CD群体种质，黄色类群(Q3)有且仅含有3份LZa群体种质，而天蓝色类群(Q4)和混合类群(Mix)分别含有2个和3个群体的种质。

图2 西藏野生石榴种质的遗传结构

表7 地理群体与理论类群之间的数量关系

3 讨 论

目前国内石榴遗传多样性研究主要集中在几大主产区内的栽培石榴，而对于西藏野生石榴遗传多样性的分析研究欠缺。在本研究中，使用的13对SSR引物平均PIC为0.393，根据Botstein等[24]的划分标准，13对引物平均表现出中度的多态性，表明这些位点可用于野生石榴种质的遗传多样性分析。用于野生种质研究13对引物平均PIC低于洪文娟等[4]对12份栽培种质研究中使用的15对SSR引物平均多态性信息含量(PIC=0.437)，也低于Aziz等[11]用于研究巴基斯坦野生石榴资源的41对SSR引物的均多态性信息含量(PIC=0.54)。这可能由于目前收集到的野生石榴种质数量有限及其分布范围小，造成所用SSR引物在野生种质中未表现出相对较高的多态性信息含量，未来可扩大野生石榴种质资源的搜集范围，丰富野生资源的遗传多样性。3个野生石榴群体的平均有效等位基因数(Ne=1.867)和香农信息指数(I=0.646)高于21份新疆石榴种质(Ne=1.352，I=0.310)[25]和39份山东枣庄石榴种质(Ne=1.352，I=0.310)[26]，说明野生种质的遗传变异丰富。LZb群体的遗传多样性水平高于CD群体和LZa群体，这可能是由于LZb群体包含有5个不同的采样点，其野生石榴种质来源和分布范围更为广泛，因此在之后的资源保护工作中可对LZb群体种质予以优先保护。

遗传分化系数(Fst)值为0～1，Fst值高于0.15说明群体间存在显著的遗传分化[27]，本研究中野生群体间的Fst为0.116，说明总体来看群体间遗传分化不显著。与赵丽华[28]对7个石榴居群遗传变异研究结果相似，本研究中石榴群体间的遗传变异也主要存在于群体内。而进一步分析发现，CD群体与LZa群体两群体之间的遗传分化程度显著，推测可能两群体内种质可能来源于LZb群体不同区域，同时由于地理隔离及遗传漂变影响，致使这两群体间遗传分化程度较大。

赵丽华等[29]依据UPGMA法，将42份来自四川和云南的石榴品种划分为4类，其结果并未与地域分布保持一致。王庆军等[30]对24个山东石榴品种构建聚类图，将供试品种划分为6类。本研究将供试野生种质划分为3个亚群，聚类结果与地理来源有一定关联，但与其地理群体来源并不完全一致，说明群体之间的遗传差异并不明显。来自同一采样点的种质也多聚在一起，说明这些来自同一采样点的种质之间亲缘关系较近。安巴村采样点内3份种质并未紧密聚类在一起，且此采样点野生石榴种质分布并不集中，可能此采样点种质祖先来源并不完全相同。遗传结构指种群中遗传变异分布的时空格局，迁移、突变、选择、遗传漂变、隔离等均是影响种群遗传结构的因素[31-32]。群体结构分析显示供试野生石榴种质有4个可能的基因库，3个群体的遗传结构具有差异，每个群体都含有其独特的基因库来源。这种差异可能是由于群体之间存在地理隔离，造成遗传变异分布的差异，并最终反映在遗传结构上[33]。

野生石榴资源含有丰富的遗传多样性，目前野生石榴生存空间受到人为活动挤压，在野生资源遗传多样性丧失之前，应尽快开展关于西藏野生石榴资源的保护工作，限制人类活动对野生资源的影响。