非洲猪瘟病毒诱导猪红细胞凋亡并促进猪外周血单核细胞的吞噬作用

杨云龙，冯永智，高 琦，郑佳琛，王 衡，张桂红,3，龚 浪*

(1.华南农业大学兽医学院/广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广东 510642；2.国家非洲猪瘟区域实验室(广州)/华南农业大学非洲猪瘟防控技术研究中心，广州 510642；3.岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心，茂名 525000)

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一种急性、热性和高度接触性传染病。近日，农业农村部报道，截至2022年4月7日，2022年发生的非洲猪瘟(African swine fever，ASF)疫情为野猪1 938起，家猪388起。ASFV是一种以软蜱和猪分别作为中间宿主和终末宿主的DNA病毒[1-2]。ASF起源于非洲，并于1921年在肯尼亚首次被报道，随后蔓延至欧洲、南美洲以及欧亚交界处等地区[3]。我国首例ASF病例于2018年8月3日被报告，在随后几个月内蔓延至全国。此外，ASF在亚洲迅速蔓延，包括越南、韩国、柬埔寨、缅甸等，严重影响猪相关产品的生产和贸易与国家的社会经济产业[4]。2022年，ASF疫情在全球持续蔓延，进一步表明需要加强对ASF疫情的监测。除了养猪企业应对ASF实行防控外，还需要对野猪感染ASFV采取有效的防控措施，以防止疫情的进一步蔓延。

ASFV是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)、非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)的成员，基因组长度为170～190 kb，为双链DNA病毒(dsDNA)。病毒在细胞质内复制，病毒颗粒呈二十面体对称，直径约为200 nm，具有同心结构，编码近200种蛋白质[5-6]。CD2v是ASFV外膜蛋白中唯一的特征性病毒蛋白，它能介导RBC与病毒产生吸附现象。CD2v由ORF EP402R基因编码，大小约45.3 ku，与T淋巴细胞表面的黏附受体CD2相似[7]。CD2v是一种糖蛋白，由一个信号肽、一个跨膜区和两个免疫球蛋白样结构域组成，它具有与CD2相似的氨基酸序列[8-11]。此外，猪红细胞(RBCs)表面有CD2受体，因此ASFV可以吸附猪RBCs。由于其他猪源病毒不能吸附RBCs，因此ASFV具有吸附RBCs的独特特性[12]。已发现从ASFV基因组中删除EP402R基因会降低ASFV引起的死亡率，并可以延缓病毒血症的发生和病毒向组织的传播，这表明CD2v介导的ASFV吸附RBCs的能力有助于病毒在宿主中的传播[11,13]。基于此，本研究拟探讨ASFV吸附RBCs后对细胞凋亡的影响，以及ASFV吸附诱导RBCs发生凋亡后对猪外周血单核细胞(PBMs)吞噬能力的影响。

在这项研究中，作者通过感染ASFV的PAMs发现了血液吸附(haemadsorption，HAD)现象。进一步研究表明，ASFV可诱导RBCs发生凋亡。还发现凋亡的RBCs可以促进PBMs的吞噬作用，表明这种现象可能是加剧宿主ASFV感染传播的另一种方式，为ASFV的感染传播和致病机制的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞和病毒

猪肺泡巨噬细胞(PAMs)、猪外周血单核细胞(PBMs)和猪红细胞(RBCs)均取自4周龄的断奶仔猪；高毒力的ASFV分离株GZ201801分离自中国广州，为基因Ⅱ型。

1.2 主要试剂

胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培养基、细胞培养级别青霉素和链霉素抗生素、0.25% EDTA-胰酶均购自Gibco公司；十八烷基罗丹明B氯化物(R18)购自Life Technologies公司；Annexin V-APC染色试剂盒，购自Keygen Biotech公司；RIPA蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂、4×Laemmle SDS-PAGE缓冲液(含有 DL-二硫苏糖醇)、DAPI染色液购自Beyotime公司；Trans-Blot Turbo快速转移系统购自Bio-Rad公司；Cleaved-caspase3、α-Tublin一抗购自CST公司；IRDye®800CW二抗购自LI-COR公司；Latex beads黄绿色荧光微球悬液购自Sigma公司。

1.3 主要仪器

CO2培养箱购自Thermo公司；细胞计数仪购自Countstar公司；倒置显微镜购自Leica公司；流式细胞仪购自Cytoflex公司；Odyssey成像系统购自LI-COR公司；激光共聚焦显微镜购自Olympus公司。

1.4 方法

1.4.1 病毒感染 将ASFV分别接种在PAMs和RBCs细胞中，并补充10%胎牛血清、2 mmol·L-1L-谷氨酰胺、100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1链霉素和0.4 mmol·L-1非必需氨基酸的培养基，并将细胞放置于5% CO2的37 ℃培养箱中培养。

1.4.2 病毒HAD50测定 参照Zhao等[14]的方法，将原代PAMs培养在96孔板中，并将病毒液进行10倍被比稀释为8个梯度，感染于96孔板中接种的PAMs，在含有5% CO2的37 ℃细胞培养箱中孵育1 h后，弃掉上清液后换成10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，同时添加含有1%的猪RBCs，在7 d内观察HAD现象，并使用Reed和Muench方法计算ASFV的HAD50[15]。

1.4.3 病毒侵染检测试验 将ASFV接种PAMs和猪RBCs，并采用流式细胞术来检测ASFV是否入侵猪RBCs。十八烷基罗丹明B(R18)是一种不溶于磷脂的亲脂性探针，可插入病毒包膜[16]。当R18插入脂质膜后，R18的荧光会自猝灭，当病毒囊膜与细胞膜融合时，探针逐渐被稀释并释放荧光信号(Ex/Em=560/590 nm)，采用流式细胞仪通过检测荧光信号可以判断病毒对细胞的入侵[17]。本研究将5 mL ASFV (HAD50=10-5·0.1 mL-1)的病毒液与5 μL R18染料(3 μmol·L-1)混合并在37 ℃细胞培养箱中避光孵育20 min。随后，将混合物接种至分别铺有1×105细胞数的原代PAMs或猪RBCs的24孔板中，将其置于4 ℃冰箱中孵育1 h以使病毒黏附到细胞表面。接下来，将板转移到37 ℃细胞培养箱中培养1 h以使病毒进入细胞。此外，将5 mL RPMI-1640培养基和5 μL R18混合并接种细胞作为阴性对照。孵育后，收集PAMs和RBCs并使用流式细胞仪检测入侵病毒的百分率。

1.4.4 细胞凋亡检测 使用Annexin Ⅴ-APC细胞凋亡检测试剂盒测定RBC凋亡情况，通过Cytoflex流式细胞仪和Cyexpert软件进行检测和结果分析。作者在1、3、5和7 d的4个时间点检测感染0.1、1、3 MOI ASFV的RBC凋亡情况。将接种5×105RBCs的12孔细胞培养板中上清液弃掉，用1 mL PBS冲洗后接种ASFV，4 ℃冰箱放置1 h后转移至5% CO2的37 ℃细胞培养箱中，孵育1 h后更换含有10% FBS的RPMI-1640培养基；随后，将细胞置于37 ℃细胞培养箱中进行培养。在接种ASFV后的1、3、5和7 d收集红细胞并使用Annexin V-APC细胞凋亡检测试剂盒处理细胞，通过流式细胞术检测RBCs凋亡情况。

1.4.5 Western blot试验 将处理并收集的细胞在添加有蛋白酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液中裂解，并添加4×Laemmle SDS-PAGE缓冲液(含有 DL-二硫苏糖醇)在100 ℃下加热15 min变性。然后根据说明书在 SDS-PAGE凝胶上分离蛋白质并使用Trans-Blot Turbo快速转移系统将蛋白转移到硝酸纤维素(NC)膜上。使用5%脱脂牛奶(溶解在 Tris 缓冲盐水中)在 37 ℃下封闭NC膜1 h，然后与兔源Cleaved-Caspase3单克隆抗体室温下孵育1 h或在4 ℃下孵育过夜。使用洗涤缓冲液(含0.1% Tween20的TBS)将膜洗涤3次(每次15 min)，并与 IRDye®800CW红外山羊抗兔源二抗在37 ℃下孵育1 h。将NC膜在洗涤缓冲液中洗涤3次，并使用Odyssey成像系统成像以显示蛋白质条带。α-Tublin蛋白用作蛋白上样内参。

1.4.6 PBMs吞噬能力检测 分别将接种1 MOI ASFV 1、2、3、4、5、6和7 d的5×105RBCs与10 μL 黄绿色荧光微球悬浮液一起添加到接种有5×105PBMs的12孔细胞培养板中，12 h后弃掉细胞上清液，并在孔板中加入1 mL PBS后放在室温摇床上进行洗涤，共洗3次，每次15 min，以将未被吞入的黄绿色荧光微球充分清洗掉，使用DAPI对PBMs进行细胞核染色，5 min后用PBS在室温摇床上洗涤3次，每次5 min，随后通过激光共聚焦显微镜观察PBMs细胞对各组黄绿色荧光微球的吞噬数量。

2 结 果

2.1 ASFV诱导RBCs发生凋亡

为探讨ASFV吸附RBCs后对RBCs的影响，本研究检测了接种ASFV的RBCs的凋亡情况。参照Zhao等[14]的方法测得ASFV的HAD50结果为10-6.875·mL-1。使用0.1 MOI ASFV接种1、3、5和7 d后，RBCs的凋亡百分率分别为1.27%、3.23%、7.39%和8.56%。使用1 MOI ASFV接种1、3、5、7 d后细胞的凋亡百分率分别为1.54%、3.73%、8.46%和10.74%。使用3 MOI ASFV接种1、3、5和7 d后，细胞的凋亡百分率分别为2.65%、5.01%、12.44%和18.61%(图1A)。接种0.1、1、3 MOI ASFV的1、3、5、7 d后，检测RBCs中Cleaved-caspase3蛋白表达水平，发现随着接种剂量和时间的增加，细胞凋亡Cleaved-caspase3蛋白的表达水平显著上调(图1B)。以上结果表明，ASFV以剂量和时间依赖性诱导RBCs发生凋亡。

A.将RBCs分别接种0.1、1、3 MOI ASFV的1、3、5、7 d后，通过流式细胞术检测RBCs凋亡情况；B.检测凋亡蛋白Cleaved-Caspase3的表达水平

2.2 感染ASFV的PAMs产生HAD现象

在接种GZ201801-ASFV后，即使在接种了100倍稀释病毒的孔中PAMs也显示出明显的HAD现象(图2)。证实基因Ⅱ型ASFV具有吸附RBCs的能力。

图2 ASFV感染PAMs产生HAD现象

2.3 ASFV侵染PAMs而非RBCs

本研究以ASFV易感PAMs为阳性对照，通过检测ASFV病毒囊膜和细胞膜的融合来判断ASFV是否侵入RBCs。通过流式细胞仪检测R18在细胞膜表面的荧光，结果显示，ASFV感染的PAMs中具42.14%的细胞检测到荧光，表明ASFV可以有效侵入PAMs；而ASFV处理的RBCs中未检测到有荧光的细胞(0.2%在仪器误差范围内)，表明ASFV不具有侵染RBCs的能力(图3)。

A. ASFV侵染PAMs的百分比；B. ASFV侵染RBCs的百分比

2.4 凋亡RBCs促进PBMs的吞噬作用

为确定凋亡的RBCs是否影响PBMs的吞噬能力，使用黄绿色荧光微球浮液来检测PBMs吞噬能力的变化。用1 MOI ASFV处理RBCs 1、2、3、4、5、6和7 d后收集RBCs，并将处理的RBCs与黄绿色荧光微球悬浮液一起添加到PBMs中。12 h后，通过激光共聚焦显微镜观察PBMs对黄绿色荧光微球的吞噬数量。结果显示，随着ASFV对RBCs处理的时间增加，被PBMs吞噬的黄绿色荧光微球数逐渐增加(图4)，蓝色为细胞核，绿色为荧光微球。通过对接种ASFV的RBCs和PBMs进行吉姆萨染色，红色箭头为加入培养PBMs中的RBCs，发现随着ASFV处理RBCs时间的增加，PBMs吞噬RBCs数逐渐增加(图5)。结果表明，随着ASFV诱导RBCs凋亡数的增加，PBMs的吞噬能力也显著增强。

图4 通过荧光微球观察ASFV处理RBCs的Control和1、2、3、4、5、6、7 dpi组的PBMs吞噬红细胞的能力

3 讨 论

RBCs是血液中最丰富的血细胞类型，它们也是无脊椎动物通过血液运输氧气的最重要介质，并且具有重要的免疫功能。RBCs程序性死亡的正常生理过程受多种内外因素影响，如氧化应激、渗透性休克、病原体感染、供能不足等。这些内在或外在因素对RBCs造成一定程度的损伤后，机体会加速受损RBCs程序性死亡，避免受损细胞破裂溶血，进一步引发炎症反应。本研究发现ASFV可诱导RBCs发生凋亡，凋亡的RBCs能促进PBMs的吞噬作用。因此，研究ASFV诱导RBCs凋亡的机制，将有助于更深入地了解ASFV的致病机制。红细胞膜由双层磷脂组成，内层含有磷脂酰丝氨酸(PS)，细胞发生凋亡后，PS外翻到细胞膜外并被携带PS受体的巨噬细胞迅速识别，从而吞噬凋亡的RBCs[18]。RBCs暴露于Ca2+离子载体离子霉素后诱导细胞皱缩、细胞膜起泡形成凋亡小体和PS外翻，随后在细胞表面暴露PS，发生细胞凋亡，PS暴露在细胞膜外表面会刺激吞噬细胞吞噬凋亡的RBCs[19],迅速将凋亡的RBCs从血液循环中清除，从而避免血液循环中存在有害的RBCs发生溶血和血红蛋白(Hb)释放[20]。PBMs是ASFV的靶细胞，当ASFV侵染猪体内后病毒进入血液感染PBMs，ASFV能诱导血液中RBCs发生凋亡并促进PBMs的吞噬功能，导致PBMs吞噬和感染病毒的数量增加。因此猜测ASFV诱导RBCs发生凋亡并促进单核细胞的吞噬功能是ASFV感染靶细胞的另一种方式。当ASFV感染PBMs时，受感染的PBMs会失去吞噬血液中凋亡RBCs的能力[21]，这种现象可能与ASFV感染引起的溶血性贫血症状有关。此外，PS外翻后会增加红细胞之间的黏附程度，增大了红细胞与血管壁之间的摩擦力，并增加了细胞凋亡诱导的RBCs细胞膜的通透性，从而导致细胞质释放的Ca2+激活纤维蛋白和血小板，活化血小板产生纤维蛋白[22]，这导致细胞黏附和聚集成明显的丝状发射状态，从而增加全血的黏度导致血管阻塞和血栓形成。

综上所述，虽然ASFV在感染猪后会吸附于RBCs，加速病毒在全身的传播，但ASFV不能侵染RBCs。说明RBCs不能成为潜在的ASFV靶细胞，然而ASFV可诱导RBCs发生凋亡并提升PBMs的吞噬能力。因此，阻止ASFV吸附RBCs可能会下调ASFV引起的RBCs凋亡水平，从而降低ASF感染引发的自身免疫性溶血性贫血的发生率。深入研究ASFV诱导RBCs细胞膜的脂质代谢、离子通道的激活等，可为ASF的防治提供更全面的理论依据。尽管针对ASF的疫苗正处于研发阶段，但仍需要对ASFV的致病机制进行深入研究。因此，通过阐明ASFV与宿主细胞的相互作用，可以对ASF实施更有效的预防、控制和治疗措施，以降低ASF对养猪业和国民经济造成的危害。

4 结 论

本试验检测ASFV对RBCs的作用，发现ASFV不能入侵RBCs，但以时间和剂量依赖性方式诱导RBCs发生凋亡。同时，通过吉姆萨染色试验和绿色荧光微球的处理发现，凋亡的RBCs可以增加PBMs的吞噬功能，ASFV诱导RBCs凋亡的百分比越高，PBMs的吞噬能力越强，表明这种现象是加剧宿主ASFV感染传播的另一种方式。本研究为ASFV的感染传播和致病机制的研究提供理论基础。