miRNA-5585-5p靶向调控多聚免疫球蛋白受体在乳腺癌中的表达及临床意义

梅 帅,裴文浩,吴 倩，黄 驰，李怡彤，许培海,刘俊涛,丁勇兴

乳腺癌在全球范围内发病率逐年上升，已位居女性癌症首位；也是全球癌症发病的主要原因之一，占所有癌症病人的11.7%，每年死亡人数为68.5万人，死亡率高达6.9%，是全球第五大癌症死亡原因[1]。根据病人的激素受体及人上皮生长因子受体2(HER-2)表达情况，可将乳腺癌分为4种分子亚型[2]，分子亚型与乳腺癌的治疗和预后密切相关，探索乳腺癌预后相关因素有利于早期诊断和靶向治疗。微小RNA(microRNA，miRNA)是一种长度在19～25个核苷酸的非编码RNA，其可以通过和靶基因mRNA的碱基配对，引导沉默复合体降解mRNA或阻碍其翻译，从而发挥癌基因或抑癌基因的作用。本课题组前期研究[3]发现，miR-5585-5p可促进乳腺癌的发生发展，利用TCGA数据库分析发现，多聚免疫球蛋白受体(Polymeric immunoglobulin receptor,pIgR)在癌症组织中表达较癌旁组织降低，且与miR-5585-5p存在结合位点。本研究旨在进一步分析乳腺癌组织中miR-5585-5p和pIgR的差异表达情况，并分析其与临床病理学特征的关系及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 临床病理标本选自2020年1-12月蚌埠医学院第一附属医院甲乳外科及中德乳腺科手术治疗的44例乳腺浸润性导管癌BRCR石蜡包埋组织(BRCR组)，另选取同期5例非癌症病人的正常乳腺组织标本作为对照组(NCT组)。纳入标准：病人手术前无长期服用非甾体类抗炎药物史；无其他恶性肿瘤病史；其中乳腺癌病人术前检查时未发现明显的远处转移，且手术前、手术中均未进行内分泌或放化疗治疗等。观察组病人均为女性，年龄35～55岁。由2位病理医生对所有标本的病理结果进行确认，其中组织学分级Ⅰ～Ⅱ级22例，Ⅲ期22例；淋巴结转移26例，其中淋巴结转移数目≥3个16例；病理类型均为浸润性导管癌。对照组病人均为女性，年龄37～54岁。2组性别、年龄均具有可比性。

1.2 免疫组织化学法检测BRCR及NCT中pIgR表达情况 将石蜡包埋的乳腺组织块做4 μm厚连续石蜡切片，脱蜡至水化，滴加3% H2O2，室温孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶，PBS 洗3遍；修复抗原，37 ℃ 湿盒中孵育一抗2 h，PBS洗3遍；37 ℃湿盒中孵育二抗1 h，PBS洗3遍；DAB显色；显微镜下观察拍照。pIgR免疫组织化学结果判定：以细胞膜出现棕黄色颗粒为判断标准，不着色或着色阳性的细胞数≤10%计0分，>10%为阳性，其中着色弱且不连续计1分，着色中等或部分不连续计2分，着色强且连续计3分。将0分、1分判定为PIGR低表达；2分、3分判定为PIGR高表达。

1.3 荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测miR-5585-5p对pIgR调控作用

1.3.1 材料与试剂 Trizol试剂(Invitrogen公司)；焦碳酸二乙酯(DEPC)采购于Sigma公司；qRT-PCR试剂、反转录试剂盒(Genecopoeia 公司)； DEPC(Sigma公司)；兔抗人PIGR一抗(proteintech公司)。人乳腺癌细胞株SKBR-3采购于中国科学院细胞研究所；新生胎牛血清采购于LONSA公司；DMEM培养基采购于Gibco公司；has-miR-5585-5p mimics采购于上海吉玛制药技术有限公司。

1.3.2 细胞培养 SKBR-3细胞使用含10%灭活胎牛血清的DMEM高糖培养基，培养于37 ℃、5% CO2环境的细胞培养箱中，定期观察细胞生长状态，待细胞密度生长至70%左右时分瓶传代或进行后续实验。

1.3.3 细胞铺板 将处于对数生长期的细胞经胰酶消化，1 000 g离心5 min，弃上清液，加入1 mL 10%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，细胞计数后以每孔10万个细胞接种于6孔板内，次日进行转染。

1.3.4 细胞转染 将处于对数生长期的SKBR-3细胞接种至6孔板，当细胞密度达50%～60%时，设空白对照组与实验组，其中空白对照组加入2 mL无血清培养基，实验组每孔加入500 μL转染试剂(A液为250 μL Opti-MEM+5 μL Lipofectamine 2000，B液为250 μL Opti-MEM+5 μL miR-5585-5p mimics，has-miR-5585-5p mimics序列：UGA AGU ACC AGC UAC UCG AGA G，将A、B液混合均匀后静置一段时间即可)和1.5 mL无血清培养基，轻轻摇晃均匀后移入细胞培养箱中培养。

1.3.5 RNA提取 利用胰酶消化细胞，1 000 g离心5 min，弃上清液，加入1 mL Trizol(裂解液)重悬细胞，反复吹打，充分混匀后转移至预冷的1.5 mL无酶Ep管中，冰上静置10 min；加入0.2 mL三氯甲烷剧烈振荡15 s成乳状，冰上放置5 min；冷冻离心机12 000 g、4 ℃离心15 min；吸取上清液至新的1.5 mL无酶Ep管中，以枪头不吸到中层的情况下尽量多吸，加入与上清液相同体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置15 min，每隔5 min混匀一次；冷冻离心机12 000 g、4 ℃ 离心10 min，弃上清液，倒扣干净；加入1 mL 75%乙醇，洗涤RNA，旋涡震荡均匀；冷冻离心机 7 600 g、4 ℃离心5 min，弃上清液，加入适量DEPC水，充分溶解RNA，置于-80 ℃冰箱中备用。

1.3.6 qRT-PCR 采用逆转录试剂盒，将上述提取的RNA逆转录为cDNA；利用SYBR荧光染料法，进行PCR扩增，以GAPDH为内参，所用引物序列见表1。qRT-PCR反应参数：95 ℃预变性10 min，95 ℃ 5 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。获得数据采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。

表1 引物序列

1.4 生物信息学分析miR-5585-5p对pIgR调控作用 利用TargetScanHuman7.2 miRNA靶基因数据库，检索pIgR是否与miR-5585-5p存在结合位点。利用癌症基因组图谱(TCGA)数据库，分析pIgR在乳腺癌组织与正常乳腺组织中的差异表达，并进行生存分析。

1.5 统计学方法 采用t检验、χ2检验和四格表确切概率法。

2 结果

2.1 生物信息学分析miR-5585-5p与pIgR潜在结合位点 利用TargetScanHuman7.2数据库分析结果显示，miR-5585-5p与pIgR存在结合位点(见图1)，表明pIgR可能为miR-5585-5p的潜在靶基因之一。

2.2 miR-5585-5p下调pIgR表达 为进一步证实miR-5585-5p对pIgR表达的调控，以miR-5585-5p类似物转染乳腺癌细胞SKBR-3，利用qRT-PCR检测pIgR mRNA相对表达量，结果显示，实验组pIgR表达明显低于空白对照组(P<0.01)(见表2)。

表2miR-5585-5p对乳腺癌细胞SKBR-3中pIgR表达的影响

2.3 生物信息学分析乳腺癌组织中pIgR表达及临床意义 为分析pIgR在乳腺癌组织中差异表达情况，从TCGA数据集(https://portal.gdc.com)获取1 090个乳腺癌肿瘤的RNA测序数据(第3级)和相应的临床信息，另从TCGA数据库获取对照组113例良性病例组织样本数据，统计分析结果显示，pIgR在乳腺癌病人癌组织中表达明显低于良性对照组(P<0.01)(见表3)，且不同分期乳腺癌病人肿瘤组织中pIgR表达均低于良性对照组(P<0.01)，但不同分期间差异无统计学意义(P>0.05)(见表4)。根据pIgR表达，将乳腺癌病人分为pIgR低表达组(n=545)和高表达组(n=545)进行生存分析，pIgR低表达组5年生存率为20.18%，病人生存时间中位数为2.07年，上四分位数为4.28年，下四分位数为1.12年；pIgR高表达组5年生存率为25.69%，病人生存时间中位数为2.58年，上四分位数为5.13年，下四分位数为1.37年，pIgR低表达组病人5年生存率低于高表达组(χ2=5.38，P<0.05)。

表3TCGA数据库中乳腺癌与正常组织中pIgR的差异表达

表4pIgR在不同分期乳腺癌病人肿瘤组织中的表达

2.4 pIgR在乳腺浸润性导管癌病人肿瘤组织中表达 利用免疫组织化学方法比较pIgR在BRCR组与NCT组中表达情况，结果显示，pIgR在BRCR组表达明显低于NCT组(见图2)。

2.5 pIgR的表达与乳腺浸润性导管癌病人临床病理关系 基于pIgR在BRCR组病人中表达水平，分析pIgR表达与病人临床病理的相关性，结果显示，不同年龄段、PR表达病人的pIgR表达差异均无统计学意义(P>0.05)，而不同组织学分级、淋巴结转移数目和HER-2、ER表达病人的pIgR表达差异均有统计学意义(P<0.05～P<0.01)(见表5)。

表5pIgR表达与乳腺浸润性导管癌病人临床病理特征关系(n)

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，目前临床针对乳腺癌主要采用手术为主、化疗为辅的治疗方式，但不同分子分型的乳腺癌病人治疗方案各不相同[4-5]。乳腺癌是一种异质性疾病，其组织中的生物学指标ER、PR、HER-2的表达情况往往是治疗方法选择及评估病人预后的决定性因素[6-7]。因此，初期诊断时准确评估乳腺癌病人临床病理特征和分子分型，在治疗方案的选择、预后评估等方面具有重要意义。

miRNA是一种长度在19～23 nt的一段非编码小RNA，通过与mRNA的3′非编码区结合来抑制基因的表达。研究[8]显示，与ER阴性肿瘤组织样本相比，ER阳性的乳腺肿瘤中miR-196a表达水平更高，且miR-196a通过靶向抑制SPRED1表达增强了人乳腺癌细胞MCF-7的细胞增殖、迁移和侵袭能力。KUDO等[9]研究表明，miR-183-5p靶向调控PLK1基因，有效降低其蛋白表达，这种miRNA驱动的PLK1表达调节使乳腺癌细胞对PLK1特异性抑制剂NMS-P937敏感，从而协同促进细胞凋亡。本课题组前期研究[3]发现，miR-5585-5p在乳腺癌紫杉醇耐药诱导中发挥重要作用。本研究通过TargetScanHuman 7.2数据库预测pIgR可能是miR-5585-5p的靶基因之一，在人乳腺癌细胞中转染miR-5585-5p模拟物后，pIgR mRNA的表达明显下调，证实miR-5585-5p可下调pIgR的表达。

pIgR是二聚体IgA和五聚体IgM的特异性受体，广泛分布于上皮细胞基底，介导IgA与IgM的跨膜转运，在固有免疫及适应性免疫之间起充当链接的桥梁作用，是黏膜免疫与抗感染免疫中的重要成分[10]。近年研究[11-12]发现，pIgR在不同癌症中发挥不同作用，如在肺癌、胰腺癌、鼻咽癌中呈低表达，而在结肠癌、卵巢癌、食管癌及肝癌等癌症中表达上调。LIU等[13]研究发现，pIgR阳性表达与结肠癌肝转移相关，结肠癌肝转移中pIgR表达阳性病人的总生存期明显低于pIgR表达阴性病人，结肠癌肝转移中pIgR阳性是肝切除术后总生存期的独立预后因素。QI等[14]研究证实，pIgR低表达与晚期临床分期、T分期、N分期和远处转移密切相关，pIgR低表达的鼻咽癌病人总生存期明显短于高表达病人，可作为判断鼻咽癌病人预后的独立指标。

BAO等[15]利用测序技术，鉴定乳腺癌差异表达基因(DEGs)，发现pIgR在乳腺癌中表达下调，分析其可能通过与细胞外基质受体相互作用，在乳腺癌中发挥重要作用。XIAO等[16]研究发现，pIgR在相对低风险的乳腺癌病人中表达水平高于高风险组，提示pIgR的低表达可能与乳腺癌病人的预后不良相关。本研究首先利用TCGA数据库分析乳腺癌病人肿瘤组织与良性病例间pIgR的差异表达，发现pIgR在乳腺癌组织中表达明显低于良性组织；生存预后分析结果亦表明，低表达pIgR病人的5年生存率明显低于高表达病人，表明pIgR表达可能与乳腺癌发生发展及预后相关。因此，本研究进一步采用乳腺癌临床样本，分析pIgR表达与乳腺癌临床病理的相关性，结果显示，相对于乳腺良性肿瘤，乳腺癌组织中pIgR表达下调，且不同年龄段、PR表达情况的乳腺癌病人pIgR表达差异均无统计学意义，而不同组织学分级、淋巴结转移数目和HER-2、ER表达病人的pIgR表达差异均有统计学意义，提示其可能可作为生物标志物，帮助进行乳腺癌的分子分型和预后判断。

综上，miR-5585-5p可靶向调控pIgR表达，乳腺癌病人pIgR低表达可能与淋巴结转移和HER-2过表达相关，这为乳腺癌的早期筛查、分子分型及治疗方案的制定提供了一定参考价值。