3-溴丙酮酸对美国白蛾核型多角体病毒的增效作用

刘瑞霞，李恩杰，柏 超，王青华，段立清

(1.中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所/国家林业和草原局森林保护学重点实验室，北京 100091；2.内蒙古农业大学林学院，内蒙古 呼和浩特 010019；3.中国林业科学研究院华北林业实验中心，北京 102300；4.北京市新海园林工程有限公司，北京 100018)

美国白蛾（Hyphantria cunea(Drury)）属鳞翅目(Lepidoptera)灯蛾科(Arctiidae)，是一种极易暴发成灾的世界性的检疫害虫，也是我国重大外来入侵害虫。美国白蛾具有食性杂、适应性强，繁殖量大、危害严重，传播速度快等特点[1-2]，2019年被国家林业和草原局列为二级危害性林业有害生物（国家林业和草原局公告2019年第20号）。美国白蛾于1979年首次在我国辽宁丹东地区发现，此后由东向西扩散，到2019年疫区已经扩散至北京、河北、内蒙古、河南、江苏和安徽等13个省（区、市）的598个县级行政区[3]；到2020年，发生面积已达74.64万hm2，扩散范围进一步加大，仅疫区就新增11个[4-5]；2021年疫区已涉及13个省（区、市）的607个县级行政区（国家林业和草原局公告2021年第7号）。据预测分析，随着气候变化，美国白蛾潜在生境整体向中国北部和内陆湿度较高地区偏移，黑龙江、四川、山西、台湾等地区未来可能成为美国白蛾主要潜在的发生区域[6]。为了减少美国白蛾的危害，人们研究了多种防治药剂，其中化学农药因具有易加工、高效杀死大量个体等特点而在美国白蛾防治中发挥了重要作用，但其所带来的负面影响，如环境污染，易产生药害、抗药性、杀伤天敌、破坏生态系统等问题，促使人们偏向开发和利用安全、高效、可持续的生物防治药剂。

美国白蛾核型多角体病毒（Hyphantria cunea nucleopolyhedrovirus，HycuNPV）具有毒力强，对寄主专一，对环境和人畜安全，不杀伤天敌等优点，成为美国白蛾生物防治中重要的一种病原微生物杀虫剂[7]。但其自身也有一定的缺陷，如病毒的大量复制只能通过活体繁殖，生产成本和防治成本较化学农药均相对较高；另外，病毒侵染害虫到致病通常需要一定的周期，在该周期内，病虫的取食量几乎不减少，仍会对农林作物造成一定的损失[8-9]，这些因素制约了HycuNPV杀虫剂的发展。因此，研究和开发能够提高HycuNPV的杀虫效率、缩短杀虫时间的增效剂资源，成为扩大该病毒杀虫剂推广应用的重要途径[10-12]。

3-溴丙酮酸（3-bromopyruvate，3-BrPA）既是杀菌剂噻菌灵的中间体，也是糖酵解产物中丙酮酸的类似物，对糖酵解途径的限制酶——己糖激酶（hexokinase II，HKII）的活性具有抑制作用[13]。已有研究表明，3-BrPA在医学上可用于抑制肿瘤细胞ATP的产生[14-15]，并会抑制真菌的繁殖[16]，被称为是一种新型、高效、无污染的生物制剂[17-18]。在病虫害防治方面，高剂量的3-BrPA对秀丽隐杆线虫具有毒性，低剂量的3-BrPA会延长线虫的生长发育时间[18-19]；此外，3-BrPA对美国白蛾幼虫生长发育也具有显著的抑制作用[20]。为此，本研究利用3-BrPA作为HycuNPV的生物增效剂，探讨3-BrPA对HycuNPV的毒力影响和对美国白蛾生长发育的影响。以期利用3-BrPA作为HycuNPV的增效剂提高病毒对美国白蛾的杀虫效果，为HycuNPV杀虫剂的广泛应用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

美国白蛾核型多角体病毒（HycuNPV）、美国白蛾3龄幼虫和人工饲料均由中国林业科学研究院林业昆虫病毒研发中心提供，3龄幼虫于温度（25±1）℃，相对湿度（60±10）%，光周期16L∶8D的昆虫饲养室中饲养。3-BrPA（纯度≥95%）购自北京爱博森生物试剂有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 3-BrPA对HycuNPV的增效作用的测定 美国白蛾3龄幼虫置于养虫杯（Φ6.3 cm×5.2 cm）饥饿处理24 h。3-BrPA添加剂量分别为5.0、10.0、15.0、20.0和25.0 mg·g-1时；纯 化的HycuNPV悬浮液依次稀释为3.0×107、9.0×106、3.0×106、9.0×105和3.0×105OBs·mL-1。将上述3-BrPA与HycuNPV混合加至养虫杯，混合的加入方法具体如下：先将3-BrPA加入每杯含有（20±0.5）g的人工饲料表面，待渗入饲料后，再将HycuNPV悬浮液加入，自然晾干，接入试虫，并设置无菌水为对照组。每组选取健康幼虫10头，重复3次。自接毒后第3 d开始每天记录美国白蛾幼虫死亡症状和死亡数，直至虫体全部死亡或化蛹[21-22]。

1.2.2 3龄幼虫发育历期、羽化率和化蛹率的测定 选取浓度为9.0×105和3.0×105OBs·mL-1的HycuNPV，并分别添加剂量为5.0、10.0、12.5和15.0 mg·g-1的3-BrPA对美国白蛾3龄幼虫进行接毒，分析不同处理对美国白蛾幼虫的发育历期、化蛹率和羽化率的影响。

1.3 数据分析

应用Excel 2021处理数据，运用SPSS 22.0进 行probit分 析，分 别 求 出3-BrPA对HycuNPV的致死中浓度（LC50）和致死中时间（LT50），并用单因素方差分析（ANOVA），Tukey test（P＜0.05）分析幼虫发育历期、化蛹率和羽化率等[23]。

1.3.1 增效倍数与共毒系数 增效作用采用增效倍数（SR）与共毒系数（CTC）来衡量[11]，计算公式如下：

上式（1）中SR的计算和评价参考刘海明与段彦丽等人的方法[11、24]，增效倍数（SR）＞0，表示为增效作用；（SR）＜0，表示为拮抗作用；（SR）=0，表示为无增效作用。

上式（2）根据复配剂的联合作用划分标准，共毒系数（CTC）≥120，则药剂复配表示为增效作用；若CTC≤80，则表示拮抗作用；若80＜CTC＜120，则表示为相加作用[25-26]。

2 结果分析

2.1 不同处理对美国白蛾3龄幼虫的LC50和增效作用分析

由表1可知，HycuNPV悬浮液在不同剂量的3-BrPA作用下，其毒力出现显著差异。当3-BrPA的添加剂量为0时，仅含有HycuNPV的对照组LC50为4.362×105OB·mL-1；当3-BrPA的添加剂量低于15.0 mg·g-1时，HycuNPV的LC50均低于 对 照 组 的LC50；添 加15.0 mg·g-13-BrPA的HycuNPV与对照组相比，LC50并没有显著的差异。也就是说，随着添加3-BrPA的剂量降低，LC50差异逐步增大。同时根据增效作用计算可知，当3-BrPA的添加剂量分别为5.0、10.0和15.0 mg·g-1时，增效倍数（SR）分别为825.14、164.72和0.47，共毒系数（CTC）分别为82 613.63、16 579.25和147.27。由此可见，添加5.0和10.0 mg·g-1的3-BrPA对HycuNPV具有明显的增效作用，且前者的增效作用最显著。

表1 不同处理对美国白蛾3龄幼虫的LC50和增效作用分析Table 1 Analysis of LC50 and synergistic effects of different treatments on the 3rd instar larvae of H.cunea

2.2 不同处理对美国白蛾3龄幼虫的LT50分析

不同浓度的HycuNPV悬浮液在不同剂量的3-BrPA作用下的杀虫速度如表2所示。不同浓度的HycuNPV在不同剂量的3-BrPA作用下，其杀虫效果各不相同。在浓度为3.0×107OBs·mL-1的HycuNPV中添加5.0 mg·g-1的3-BrPA，LT50最短（3.112 d），添加10.0 mg·g-1的3-BrPA次之（3.710 d）；在 浓 度 为9.0×105OBs·mL-1的HycuNPV中添加5.0 mg·g-1的3-BrPA，LT50缩短时间最长，达9.724 d。

表2 不同处理对美国白蛾3龄幼虫的LT50分析Table 2 Analysis of LT50 of different treatments on the 3rd instar larvae of H.cunea

当HycuNPV浓度为3.0×107和3.0×106OBs·mL-1时，添加15.0 mg·g-1的3-BrPA会使LT50延 长；添 加5.0 mg·g-1的3-BrPA会 缩短LT50，相比较对照，分别缩短4.628 d和6.376 d。当HycuNPV浓度为9.0×106OBs·mL-1时，添加3-BrPA均会使LT50延长。当HycuNPV浓度为9.0×105和3.0×105OBs·mL-1时，添加3-BrPA均可使LT50明显缩短，且随着3-BrPA添加剂量的降低，LT50的差异逐步增大。

当3-BrPA的添加剂量为5.0 mg·g-1时，仅有浓度为9.0×106OBs·mL-1的HycuNPV的LT50延长了，其余浓度的HycuNPV的LT50均明显缩短，其中浓度为9.0×105OBs·mL-1的HycuNPV的LT50缩短时间最长（9.724 d）。当3-BrPA的添加剂量为10.0 mg·g-1时，浓度为3.0×107、9.0×105和3.0×105OBs·mL-1的HycuNPV的LT50缩短了，且浓度 为9.0×105OBs·mL-1的HycuNPV的LT50缩短时间（7.070 d）明显长于其余2个浓度(4.030 d和3.280 d)。当3-BrPA的添加剂量为15.0 mg·g-1时，仅有浓度为9.0×105和3.0×105OBs·mL-1的HycuNPV的LT50出现缩短。

综上所述，在一定浓度的HycuNPV中加入低剂量的3-BrPA，会显著提高病毒的杀虫速度。

2.3 不同处理对美国白蛾幼虫发育历期的影响

由表3可以看出，不同浓度的HycuNPV悬浮液在不同剂量的3-BrPA作用下，美国白蛾幼虫的3龄发育历期和总发育历期（3龄起）都得到延长。当3-BrPA的添加剂量一定时，浓度为9.0×105OBs·mL-1的HycuNPV感染的美国白蛾幼虫3龄发育历期的延长时间都长于浓度为3.0×105OBs·mL-1；浓度为9.0×105OBs·mL-1的HycuNPV感染的美国白蛾幼虫总发育历期的延长时间与浓度为3.0×105OBs·mL-1的几乎无差异。特别是当3-BrPA的添加剂量为15.0 mg·g-1时，浓度为9.0×105和3.0×105OBs·mL-1的HycuNPV感染的美国白蛾幼虫一直未化蛹。

表3 不同处理对美国白蛾幼虫发育历期的影响Table 3 Effects of different treatments on the larvae development duration of H.cunea

当HycuNPV浓度一定时，随着3-BrPA添加剂量的升高，美国白蛾幼虫的3龄发育历期和总发育历期均逐步变长，其中，在HycuNPV浓度为9.0×105OBs·mL-1时，添加剂量为15.0 mg·g-1的3-BrPA后，美国白蛾幼虫3龄发育历期最长，较对照组延长时间高达9.00 d。

2.4 不同处理对幼虫总存活率、化蛹率和羽化率的影响

在不同浓度的HycuNPV中添加不同剂量的3-BrPA，感染美国白蛾3龄幼虫后的总存活率、化蛹率和羽化率如表4所示。当HycuNPV的浓度为3.0×105OBs·mL-1，仅在3-BrPA剂量为12.5 mg·g-1时，美国白蛾幼虫总存活率为10.00%，化蛹率和羽化率均为33.33%；在3-BrPA其余的添加剂量下，美国白蛾幼虫总存活率都为0，无化蛹，也无羽化。当HycuNPV的浓度为9.0×105OBs·mL-1时，随着3-BrPA添加剂量的降低，美国白蛾幼虫总存活率逐渐下降，最高为30.00%，最低为13.33%；3-BrPA添加剂量为5.0、10.0和12.5 mg·g-1时，美国白蛾幼虫的化蛹率分别为66.67%、25.00%和44.44%，羽化率分别为22.22%、33.33%和9.52%。

表4 不同处理对幼虫总存活率、化蛹率和羽化率的影响Table 4 Effects of different treatments on the overall survival rate,pupation rate and emergence rate of larvae

当3-BrPA的添加剂量一致时，浓度为3.0×105OBs·mL-1的HycuNPV感染的美国白蛾幼虫总存活率、化蛹率和羽化率均低于浓度为9.0×105OBs·mL-1的HycuNPV。

3 讨论

3-BrPA为低毒性杀菌剂，安全性高，对环境无害，有望作为一种理想的昆虫病毒增效剂。已有研究表明，高剂量的3-BrPA对线虫和美国白蛾有毒性作用，且低剂量的3-BrPA可使线虫生长发育历期延长，美国白蛾的生长发育抑制[18-20]；但是，都未将3-BrPA作为增效剂与其他生物杀虫剂联合使用。本研究发现3-BrPA能够与HycuNPV联合作用，既提高了HycuNPV的毒力和杀虫速度，又表现出显著的增效作用（表1，2）。当添加3-BrPA的剂量降低时，对HycuNPV的增效倍数（SR）和共毒系数（CTC）越显著，其中3-BrPA为5.0 mg·g-1时，SR和CTC的值最大。当3-BrPA的添加剂量为5.0 mg·g-1时，仅有浓度为9.0×106OBs·mL-1的HycuNPV的LT50延长了，其余浓度的LT50均明显缩短。其中浓度为9.0×105OBs·mL-1的HycuNPV的LT50缩短时间最长。根据SR、CTC、LC50与LT50综合决定，两者联合的最佳增效配比为：9.0×105OBs·mL-1HycuNPV+5.0 mg·g-13-BrPA。

更为重要的是，3-BrPA的添加，使HycuNPV对美国白蛾幼虫的生长发育有显著的抑制作用（表3）。而HycuNPV单剂作用速度慢，即便害虫最终因感染病毒而死，可害虫在感染病毒后较长一段时间内生长发育速度正常，其对寄主的取食量并未减少，当代害虫依然对农林作物造成了严重的危害[27]。因此HycuNPV和3-BrPA的联合应用不仅保证了病毒本身控制作用的发挥，也弥补了其病毒本身的缺陷，从而有效抑制了该害虫对农林作物的危害程度，进而达到减少防治成本和农林作物经济损失的目的。此外，研究还发现，3-BrPA与HycuNPV联合作用对化蛹率和羽化率有一定的影响（表4），加入3-BrPA后化蛹率与羽化率均低于单独饲喂HycuNPV。同单独应用HycuNPV防治美国白蛾幼虫相比，3-BrPA显示出了其作为昆虫病毒增效剂的诸多优越性，可见，3-BrPA有望成为病毒增效剂的理想因子。

4 结论

3-BrPA的添加对HycuNPV具有增效作用，为HycuNPV提供新的具有应用前景的增效剂资源。