卵胞浆内单精子显微注射完全受精失败的原因和处理对策

黄莹 综述 胡少飞 审校

南宁市妇幼保健院生殖医学中心，广西 南宁 530011

辅助生殖技术发展至今，常规体外受精(in vitrofertilization，IVF)和卵胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)正常受精率的平均值分别是66.00%和73.83%[1]，但是所有的卵均未能受精的情况仍然存在，称之为完全受精失败(total fertilization failure，TFF)。TFF在IVF周期的发生率是5%~10%[2]，IVF-TFF发生后受精方式则采用ICSI，但在ICSI助孕周期，TFF发生率也有1%~4%[3]。在试管婴儿助孕周期中出现TFF，对于患者来说意味着无可利用的胚胎。如果一对夫妇经历了一次TFF，那么再助孕周期TFF的重复出现率接近30%[4]。本文就卵胞浆内单精子显微注射完全受精失败可能的原因和临床对策进行综述。

1卵胞浆内单精子显微注射完全受精失败的原因

1.1 卵母细胞激活失败(oocyte activation failure，OAF)卵母细胞激活失败是指精子注射进卵母细胞胞浆后卵母细胞激活失败，也被认为是ICSI完全受精失败的重要原因[5-6]。大多数研究认为导致OAF主要精子因素(sperm related factors)和卵子因素(oocyte related factors)两种类型[7-9]，精子因素主要有精子特异性蛋白PLCε异常表达、精子鱼精蛋白缺陷(protamine)、精子的中性粒(centrosome)和蛋白酶体(proteasomes)异常；而卵子因素有MII卵母细胞的成熟异常、染色体异常、细胞结构异常、基因表达异常和纺锤体异常等问题，但卵因素导致OAF的分子机制并不清楚。

1.2 卵母细胞的质量 在ICSI治疗周期中，受精过程中最重要的因素通常被认为是卵母细胞的质量。35岁及以上的女性经常存在卵母细胞质量下降。KULIEV等[10]研究人员发现>37岁患者的卵母细胞和胚胎中有超过50%存在染色体的非整倍体。卵巢在高剂量Gn的刺激下出现卵母细胞代谢紊乱、三磷酸腺苷含量降低、染色体转录行为异常、细胞质与细胞核的成熟不同步，从而导致完全受精失败[11]。获取适当数目成熟卵母细胞也和卵母细胞的质量密切相关，HAAF等[12]的研究发现在相同年龄组患者中，获卵数大于10枚组的卵母细胞染色体异常发生率明显增高。而张文红等[13]通过回顾821个ICSI周期得出结论：获成熟卵数≤3是发生ICSI-TFF的高危因素。

1.3 精子异常 大量的研究发现男性不育患者的精子DNA结构和数量异常、染色体核型异常的出现的几率比生育能力正常的男性显著升高[14-15]。唐永梅等[15]在ICSI受精失败的原因的综述中提到，精子形态缺陷常伴有不成熟染色质、非整倍体、DNA碎片多、染色体结构异常，严重畸形的精子会降低ICSI的受精率导致不良妊娠结局。但也有研究表明畸形精子症对ICSI的受精结局无显著影响，少精和弱精是ICSI受精失败的高危影响因素[13]。

1.4 ICSI技术和实验室环境 在进行显微注射时操作不当，例如选择不适宜的精子、精子膜损伤不充分、未能激活卵母细胞，因损伤卵母细胞胞等都可能导致完全受精失败。进行显微注射操作时环境的温度也非常重要，因为在25℃~37℃的温度下，卵子会大量地退化、崩解，而17℃~18℃的温度下卵子的存活率会大大提高[16-17]。

2 ICSI完全受精失败的临床对策

2.1 卵母细胞人工激活(artificial oocyte activation，AOA)卵母细胞人工激活是目前最常用的解决精子相关OAF的技术，应用指征：①有ICSI受精失败史；②圆头精子症是指精子缺乏顶体或存在严重的顶体畸形，分为完全型(100%为圆头精子)和部分型，在不育的男性患者中的发生率<0.1%；③特发性ICSI受精失败是指既往无受精失败病史的患者在进行ICSI操作后未能受精。AOA的方法有很多，基本原理都是增加卵母细胞内Ca2+浓度、模拟受精时的卵母细胞胞质内的生理变化[8]。一是机械激活法，是多次重复抽吸卵母细胞，通过机械刺激增加溶液中Ca2+进入细胞内的概率、破坏卵胞质中的内质网系统，从而增加内源Ca2+的释放；二是电激活法，电激活法是通过对卵母细胞施加直流电使细胞膜产生微孔，引起溶液中的Ca2+流入卵母细胞胞质内部，需要专业的电激活设备；三是化学激活法，采用Ca2+载体处理卵母细胞[8]。采用的Ca2+载体有A23187、离子霉素(ionomycin)、氯化锶(Srcl2)，均有文献报道它们可改善ICSI受精率，增加妊娠率[18-19]。2015年有学者提出并非所有患者都可以受益于AOA，而是只有精子相关激活缺陷的患者才能受益，在这些怀疑卵子相关缺陷的患者中，AOA可能无法克服受精失败[20]。AOA目前仍属于一种试验性质的技术，因为现有的激活方法不是自然的精子激活模式,无法确定所用的激活剂对胚胎质量、新生儿发育是否有副作用，对新生儿进行随访的样本量也不足以证实其无害性，所以还需要持续的研究。

2.2 形态学选择性单精子卵胞浆内显微注射(intracytoplasmic morphologically-selected sperm injection，IMSI)形态学选择性单精子卵胞浆内显微注射是指在ICSI的准备工作中，胚胎学家根据对精子的尾部、颈部和头部的评估，选择一个有正常形态及活力的精子。ICSI可以识别主要的精子形态缺陷，但不能提供关于精子核状态的信息[21]。2001年引入了活精子细胞器形态学检测(motile sperm organellar morphology examination，MSOME)技术，MSOME与ICSI相结合就是IMSI。IMSI是指在ICSI手术之前，在至少6 000以上的总光学放大率下进行的、选择没有核空泡的精子，核空泡被认为与植入期间和/或植入后胚胎发育受阻有关[22-24]。因此，IMSI被提议作为常规ICSI的替代方案，用于反复ICSI失败的夫妇及DNA片段异常的夫妇。但是IMSI在随后的受精、胚胎发育、植入、怀孕和流产率方面的效率一直是几项研究的焦点，并且是存在争议的[25-26]。2018年的一篇Meta指出，单纯男性因素亚组IMSI较ICSI受精率降低5%，差异无统计学意义；合并男性因素亚组IMSI较ICSI的受精率增加9%，且差异有统计学意义[27]。所以IMSI应用于ICSI-TFF的患者尚需要权衡考虑，需更多的临床随机对照研究进一步明确其临床应用范围和价值。

2.3 优化促排卵、再次促排方案 控制性超促排卵治疗是进行ICSI助孕的起始环节，在治疗中卵泡尽可能发育一致化，取卵时获得的卵母细胞才与自然周期主导卵泡质量相近[28-29]。控制性超促排卵治疗的目的是使患者在同一超促排卵周期募集多个卵母细胞，但多个卵母细胞同时发育，必定存在着卵母细胞发育不同步的现象。有文章提出当不成熟卵母细胞在同一取卵周期获得卵子数的比率大于25%时，当周期的卵子受精率和临床妊娠率就会明显下降；卵泡液中恰当比例的雌孕激素可以促进卵母细胞的成熟，当卵泡液中10≤P/E2≤30时，卵母细胞成熟率最高[30]。卵母细胞的成熟率也受成熟卵泡比例与注射HCG的时机的影响，当HCG日成熟卵泡(≥18 mm)比例≤20%时，其卵母细胞成熟率显著低于成熟卵泡比例>20%的患者[31]。因此，对于超促排卵治疗过程中既往有较多未成熟卵的患者，应该适当延长HCG注射至取卵的时间，这样对提高胚胎质量和妊娠率有一定帮助。获卵数≤3个也是TFF的一个重要的危险因素，注射1~2个卵时，ICSI完全受精失败风险高达37%，但是如果注射5个以上卵时，风险将降至0.8%；在获卵数≤5个的周期中，患者没有胚胎移植的风险将大大提高[32]。增加卵子和成熟卵母细胞数量，可以大大降低受精失败的风险。对于各种原因引起的初次出现的ICSI后全部受精失败，因为可能由于卵子质量与ICSI过程中的问题，再次促排卵后ICSI仍然是必要的治疗方法。

2.4 其他的临床对策 供精或者供卵：在现有的医疗水平下，TFF缺乏有效解决措施，选择使用供精或者供卵是可供考虑的选择。

3 结语

ICSI助孕周期中TFF的发生率较低，发生ICSI-TFF的原因可能是卵母细胞激活失败、卵子质量差、精子异常、ICSI的实验室技术和环境，目前也没有行之有效的解决方法，临床对策有卵母细胞人工激活、形态学选择性单精子卵胞浆内显微注射、优化促排卵方案、供精或供卵。发生ICSI-TFF后应结合临床和实验室的原因进行综合分析，并采取相应的处理方案。